壳聚糖衍生物的制备及其抗新城疫病毒活性研究毕业论文(编辑修改稿)

壳聚糖衍生物的制备及其抗新城疫病毒活性研究毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

抗菌、抗病毒等生物活性。 近年 来研究人员不断探索壳聚糖衍生物的制备，以求提高壳聚糖水溶性、专一性、 高效性，使之广泛用于农业、工业、食品业、化妆品业及医药行业等，实现产 业化生产。 壳聚糖 衍生物 抗病毒活性概述 海洋生物多糖从来源上可分为海藻多糖和海洋 动物多糖，目前多种海洋微生物也被发现可产生生物活性多糖 [58]。 多糖是生命有机体的重要组分，并在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机 体正常代谢等方面具有重要作用 ，主要影响免疫系统中的网状内皮系统、巨噬细 胞、淋巴细胞及白细胞，促成RNA、 DNA、蛋白质的合成、抗体的生成、补体的生成以 及对干扰素的作用，从而增强机体免疫功能，使抗病毒能力增强， 从而达到抗衰老、抗放射线、抗肿瘤以及抗肝炎等目的 [59] [60]。 海洋动物多糖中， 壳聚糖具有激活机体 免疫 系统、介导机体 免疫 系统的系列生物学效应 ， 提高吞噬细胞的系统功能 ， 而被认为是解决病毒性疾病等难题的关键。 壳聚糖作为抗病毒药物的载体的研究已经屡见不鲜 [6163]，这与其良好的免疫活性、生物相容性、可降解性及其良好的控释效果是分不开的。 壳聚糖作为单独的抗病毒药物可抑制几十种植物病毒、类病毒的侵染，如对大豆花叶病毒和烟草花叶病毒，并对植物病毒种类没有明确的局限性 [64, 65]，但与壳聚糖的分子量、聚合度、浓度及植物宿主种类有关。 壳聚糖的抗病毒 机制为促进巨噬细胞活性，影响非杀伤性细胞（ NK）活性白介素的分泌， 刺激辅助 T细胞的生长， 这也是其抗癌的主要机理之一 [28]。 巨噬细胞是抗原呈递细胞，与辅助 T细胞联系后，启动体液和细胞免疫系统 [66]。 巨噬细胞表面存在着 微生物 多糖的受体， 壳聚糖作为 微生物 多糖的类似物，能刺激巨噬细胞活化，产生如 下反应：摘要 11 促进其吞噬功能，增强它在其它免疫应答中的 协同效应，从而实现机体对 T细胞、 NK 细胞和 B细胞的调节，介导机体的细胞免疫应答和体液 免疫应答； 此外， 壳聚糖 被认为有 干扰 遗传物质 的复制与转录 的功能， 壳聚糖通过诱导病程相关蛋白，积累次生代谢产物和信号传导等方 式来达到抗菌 、抗病毒 的目的。 壳聚糖作为抗病毒药物的载体的研究已经屡见不鲜 [6163]， 而 作为单独的抗病毒药物 ， 可抑 制几十种植物病毒、类病毒的侵染，如对大豆花叶病毒和烟草花叶病毒。 壳聚糖 对植物病毒种类没有明确的局限性 [64, 65]，而与自身的 分子量、聚合度、浓度 等 有关。 经过衍生化修饰的壳聚糖 ， 一方面 能够调控与免疫相关的辅助细胞的功能活性，如巨噬细胞和粒细胞等。 另一方面巨噬细胞和自然杀伤性细胞的相互作用诱导干扰素的产生，干扰素通过破坏基因组 RNA或早 期mRNA而破坏转录，抑制病毒复制，因而在动物病毒的防治上也具有广泛的应用基础 [66]。 壳聚糖衍生物作为抗病毒首要的开发前景 海洋多糖来源丰富， 由于生长环境不同， 海洋动物、海洋植物以及海洋微生物都能合成出不同于陆地植物的带有大量电 荷、含有糖醛酸及硫酸酯的多糖。 随着陆地资源的消耗，海洋生物多糖的作用逐 渐被发现，它不仅具有明显的生物学活性，而且无毒副作用 [60]， 具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、抗病毒 以及作用于心脑血管等活性，海洋生物活性多糖 的研究开发已成为一个热门领域[58]。 海带多糖和大部分的海藻多糖等都具有免疫调 节作用 [67]，海藻细胞壁中的多聚硫酸脂多糖能阻止小鼠自身免疫系统脑脊 髓炎的发生；钝顶螺旋藻多糖可提高病人杀伤细胞的细胞活性；寡褐藻胶，寡 几丁质等寡聚糖片段能在病原侵入时启动植物的防御机制，诱导植物自身抗性 基因的表达，达到防御植物病害的目的，多种海洋多糖已被制成药物和保健品 出现在市场上 [68]。 壳聚糖具有如抗凝、溶栓、降血糖、抗氧化、 抗肿瘤、抗炎、抗细菌、抗病毒、抗原虫等生物活性 ， 能 激活机体 免疫 系统和介导机体系统的系列生物学效应，提高吞噬细胞的系统功能。 1958 年， GERBER首次报道了多糖硫酸酯 具有抗病毒活性，能强烈抑制具有包膜的病毒， DEREK HORTON 和 ERNST 壳聚糖氨基 上含有 硫酸根 对白血病病毒具有显著抑制作用。 致谢 VERCELLOTTI 和 SHARON 等人发现壳聚糖磺化衍生物能抑制哺乳动物病 毒感染 ， 同时也能抑制劳舍氏白血病病毒和单纯疱疹病 毒 I 和 II[69]。 CHIAKIISHIHARA等人证明甲壳质磺化衍生物对弗兰德鼠白血病 病毒、仙台病毒和单纯疱疹病毒有作用 [34, 70]。 因此， 基于壳聚糖在抗病毒方面的优异表现 ，我们 以 不同结构类型的壳聚糖 为原料，进行分子量和氨基化的修饰，以提高 其反应活性，并试验其 对鸡新城疫病毒的抑制作用 研究， 通过鸡胚试验 、分子实验 等，对壳聚糖的 修饰、浓度以及 分子量等对 新城疫 病毒 的抑制 活性进行深入研究。 研究的内容 、 目的和意义 近年来，由于环境污染及病毒基因组的变异性 ，许多前所未闻的病毒进入人们的视野，引起恐慌。 从艾滋病、禽流感到 埃博拉病毒，每一次 病毒 的出现都给人类社会造成巨大影响， 且 病毒性疾病的发生与肿瘤 这一医疗难题 也是息息相关 [71]。 因此， 人类 与病毒性疾病的战役，已经不能 只 简单的 进行 被动抵抗了，而必须进行强有力的反击。 新城疫作为 危害养鸡业健康发展的三大主要疫病之一，不 仅给我国的家禽养殖业造成了巨大的经济损失，同时由于疫情 的发展，还极大的影响了旅游等相关产业的发展。 虽然目前由于新城疫病毒的多发性而被我国规 定为强制免疫病种，在政府组织下进行集中免疫 [72]。 然而，由于病毒的变异性及疫苗本身及接种程序所存在的 问题 ，导致目前主要的防治 新城疫的手段 ——疫苗接种，面临极大的考验。 近年来 ， 随着经贸的发展和交往的频繁 ， 新城疫病毒的流行又有了新的特征，疫苗免疫尚不完善，抗病毒化 学药物 效果不显著， 导致 至今尚无有效的治疗药物 [73]。 而且，作为免疫损伤性疾病，对于新城疫 的研究是对艾滋病、禽流感等人类迫切想要解决的免疫损伤 性疾病的研究基础。 海洋药物已成为国内外研究的热点之一。 由于 海洋生物特殊的生活环境导致体内多糖的合成过程与陆地生物不同，产生 许多结构新颖、作用独特的海洋生物多糖 [1112]，而具有很好的生物相容性、生物可降解性的 天然阳离子多糖—— 壳聚糖即为其中一种。 海洋生物多糖壳聚糖，其分子中含有正电性的 氨基，摘要 13 具有非常好的生理活性，如调节免疫、抗肿瘤 、抗菌、保湿性等，且研究发现，其可抑制几十种植物病毒、类病毒的侵染。 目前国内外对于 壳聚糖及其衍生物抑制鸡新城疫病毒的研究尚未见报道， 不同 分子 构型 、 不同 分子量 壳聚糖 及其衍生物对新城疫病毒 抑制 的 系统性 研究 是首要需解决的关键性问题之一。 因此，我们通过微波方法 及接枝 技术 制备不同 分子构型、不同 分子量的高脱乙酰度壳聚糖 及其胺代衍生物 ， 并以此为 研究对象， 对鸡胚尿囊液中血凝效价的降低作用 为指标 ， 筛选出最佳 分子构型、 分子量 及衍生物产品 ；同时，采用荧光定量PCR技术，测定细胞因子在分子及蛋白水平的变化 ，以此确定壳聚糖 衍生物 在对抗 新城疫 病毒的过程中，对于免疫系统的激活与调控， 从而确定壳聚糖 衍生物 对于机体免疫系统的影响及药效机制 ， 为壳聚糖硫酸酯成为预防与治疗 新城疫 病毒的药物打下坚实的理论基础。 致谢 第二章 不同 分子量 α壳聚糖 的 制备 及 其 抗新城疫病毒 活性 研究 传统的抗病毒药物往往存在毒副作用大或是交叉产生病毒抗药性等特点，因此 ， 亟待开发毒副作用小、抗病毒活性好的新型抗病毒药物 [74]。 壳聚糖 作为天然聚合物有很好的生物相容性、生物可降解性、无毒性以及吸收性等 ， 应用在水处理、生物医药、化妆品、农业和食品工业 等多领域 ，具有免疫、抗菌、抗病毒 、 伤口愈合、药物递送、组织工程应用等生物活性 [35, 36]。 壳聚 糖 分子量的降低，由于 导致 溶解性 的 增加 而 有利于壳聚糖活性的释放 ，可 显著提高其抗肿瘤 、 抗菌 、 抗炎 及免疫调控活性 [75]。 本文采用过氧化氢微波辅助方法，降解α壳聚糖分子量在 1kDa10kDa 之间，并采用鸡胚实验及相关分子实验，测定新城疫病毒血凝效价的变化及经过治疗后的鸡胚尿囊液中免疫因子 IL TLRIFNα/β及 TNFα的变化 ， 对壳聚糖 影响 新城疫 病毒的 RNA 含量也进行了测定。 实验原料 原料 壳聚糖原料（ 青岛 云宙生物科技 有限公司 ，脱乙酰度为 82%分子量为1160kDa）； SPF 鸡胚 （ 山东无特定病原鸡实验种鸡场 ，符合 GB/ 以及国际通用标准 ） ； 试剂 氢氧化钠 (分析纯，天津市达森化工产品销售公司 )； 乙酸钠 (优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司 )； 冰醋酸 (高效液相色谱，天津市科密欧化学试剂有限公司 )； 反转录试剂盒 （ TransScript174。 OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix， 北京全式金生物技术有限公司 ） ； 摘要 15 荧光定量试剂盒 （ TransStart174。 Top Green qRTPCR SuperMix， 北京全式金生物技术有限公司 ） ； 过氧化氢 （ 分析纯 ，天津市巴斯天化工有限公司 ） ； 病毒 ，由。 提供。 （ LASOTA 鸡新城疫病毒，原始病毒效价为 211， 96h 内致鸡胚死亡） ； 仪器 微波降解反应器 （ MASII 型，上海 新仪 微波化学 科技 有限公司） ； 透析袋（ MEMBRACEL，截留分子量为 500/1000/5000Da） ； 安捷伦 1260 凝胶渗透色 谱 仪 (美国安捷伦科技公司 )； Nicolet TM iSTM10 傅立叶变换红外光谱仪（ Thermo， USA） ； SHZD（ III）型循环水式真空泵 （ 河南巩义市英峪豫华仪器厂 ）； FD1A50 型冷冻干燥机 （ 北京博医康实验仪器有限公司 ） ； SARTORIUS 精密分析天平 （ 德国 SARTORIUS 公司 ） ； HitechKflow纯化水系统（ 上海和泰仪器有限公司 ）； Anke GL20911 型高速离心机 （ 上海安亭科学仪器厂 ）； DHG9030A型 电热恒温 鼓风干燥箱 （上海精 宏 实验设备有限公司 ） ； 旋转蒸发仪（ IKA RV/HB digital） ； 实验方法 α壳聚糖的降解 [75] 称取 α壳聚糖 12g，分子量为 1160kDa、脱乙酰度为 82%，溶解于 400mL浓度为 2%的冰乙酸溶液（体积浓度），搅拌溶解直至获 得澄清、均质的 α壳聚糖 溶液。 将 50mL 溶解后的 α壳聚糖倒入 100mL 微波反应器中，加入 30%过氧化氢 ， 600W， 70℃ 条件下，搅拌 500 r/min， 依次反应 10min、 15min、20 min、 25min、 30min、 40min、 60min、 80 min、 100min、 180min， 将获得的溶液透析、冻干并进行分子量及结构的测定。 采用高效凝胶排阻色谱对 α壳聚糖降解产物的 平 均分子量（ Mw） 进行分析。 致谢 分子量的测定 高效液相法测定壳聚糖样品分子量： 进样量： 20μL； 色谱柱： TSK G3000PWXL、 TSK G5000PWXL；流动相： 醋酸 / 醋酸钠溶液；流速： mL/min ， ；柱温： 30℃ ；检测器：示差检测器；样品浓度： %（ W%）； 采用不同分子量的葡聚糖 20xx、 1100、 670、 4 270、80、 50、 1 1kDa，对凝胶色谱柱进行校准。 低分子量 α壳聚糖抗新城疫病毒效果研究 [1, 73, 76] A) 新城疫病毒毒力测定 EID50的测定： 取鸡胚 30 枚，分 6 组，分别注射 10 10 10 10 10 109病毒原液 生理盐水稀释液 ， 37℃ 孵育 72 小时后收取尿囊液，测定 EID50=，取 150EID50≈ 106 为 病毒注射量。 B） 低分子量 α壳聚糖安全浓度测定 ： 将 不同分子量的 α壳聚糖 配成 20g/L、 10g/L、 5g/L生理盐水溶液， 分别注射尿囊腔，观察 96 小时内，完全成活，继续培养至出壳，鸡胚外 观健康完整，无残疾。 注： SPF 胚对病毒相对敏感，对药物的耐受也更为敏感 ，虽然 96 小时内完全成活，但继续培养至出壳，有状态不佳未能 成活，但孵育率为 86%，在 70%可靠值以上。 C)低分子量 α壳聚糖 抗新城疫病毒 药效测定 C1)直接抑制：将不同浓度药物与新城疫病毒混匀 后按照 1:1（ v/v） 的比例接种于鸡胚尿囊腔， 72 小时后收取尿囊液，测定其血凝效价。 低浓度直接抑制试验：分别将分子量为 992 837 451 276 262239 196。