壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究本科毕业论文(编辑修改稿)

壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究本科毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

存在不尽如意的地方 [24]。 近年来，生物大分子材料由于其可再生性，无毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等优点成为药物载体研究的热点，于是利用生物大分子材料来制备纳米药物载体的研究应运而生。 用于纳米药物载体的生物大分子主要包含蛋白质和多糖两大类。 蛋白质一般包括如明胶，白蛋白，丝蛋白等物质，多糖类一般包括如壳聚糖，海藻酸 钠，环糊精，果胶等物质。 由于生物大分子可以从自然界的动植物中获得，生物相容性良好，并且可被生物体内的酶降解，毒副作用较小，且分子上带有的羟基，氨基，羧基等大量可反应的官能团，可作为化学修饰的位点，因此它们作为药物载体材料具有广阔的应用前景 [25]。 壳聚糖 纳米粒子 在纳米药物载体领域的制备和应用 壳聚糖的结构与性质 壳聚糖也称为甲壳胺或几丁聚糖壳聚糖，是一种天然的生物高分子线性多氨基多糖，为甲壳素的脱乙酰化产物。 在自然界中，壳聚糖广泛存在于低等植物菌类，藻类的细胞，节肢动物虾，蟹，蝇蛆和昆虫的外壳，贝类，软体动物（如鱿鱼，乌贼）的外壳壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 5 和软骨，高等植物的细胞壁等，每年生物合成的资源量高大 100 亿 t，是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源 [26]。 壳聚糖的化学名称为 (14)2氨基 2 脱氧 D葡聚糖，甲壳素的化学名称为 (14)2乙酰胺基 2 脱氧 D葡聚糖 [27]。 结构式如图 所示。 图 壳聚糖与甲壳素的结构 (A) 甲壳素 (B)壳聚糖 壳聚糖的每个 C6 单元均含有一个氨基，两个自由羟基。 由于氨基的存在，它是自然界中唯一带正电荷的碱性多糖。 它不溶于水和有机溶剂，但是能溶于 PH 的乙酸（ 13 %）溶液中 [28]。 壳聚糖不与体内组织产生异物反应，在体内被溶菌酶降解为对人体无毒的 N乙 酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖 [29]。 曹等 [30]通过研究表明，壳聚糖无细胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以满足医药卫生及化妆品原料的基本要求。 壳聚糖 纳米粒子 的制备 壳聚糖缓释体系主要分为：壳聚糖纳米粒子，壳聚糖 微球 ，壳聚糖缓释片，壳聚糖缓释膜，壳聚糖缓释凝胶 5 种类型 [26]。 其中，壳聚糖 纳米粒子 载药体系比其他体系更具优势。 它能保护包埋物免受外界环境影响，以及屏蔽味道，颜色或气味，降低挥发性和毒性，控制可持续释放，增加药效等。 近几年壳聚糖 纳米粒子 的 制备和应用成为研究的热点 [31]。 壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 6 制备壳聚糖 纳米粒子 的方法有多种 [32]，其选择的依据受以下因素影响： ① 目标粒径分布； ② 有效成分的热化学性质与 稳定性； ③ 有效成分的释药动力学与重现性； ④ 载药纳米粒子 的稳定性与毒性溶剂残留。 (1)乳化交联法 乳化交联法是制备壳聚糖 纳米粒子 的常用方法之一。 它是利用壳聚糖的活性氨基基团与醛类的醛基交联，得到一种 Schiff 碱。 其反应机理如图。 此法是将壳聚糖溶液加入含有表面活性剂的油相中形成 W/O 型乳剂，再加入一定量的交联剂如戊二醛，甲醛，三聚磷酸盐，柠檬酸盐，硫酸盐和京尼平等进行化学交联固化，通过离心纯化即可制得壳聚糖 纳米粒子 [33]。 操作流程如图。 沈宏亮等 [34]利用乳化交联法制备了左氧氟沙星羧甲基壳聚糖 纳米粒子 ，并对壳聚糖 纳米粒子 的体外释药性能进行了深入的研究。 图 壳聚糖交联反应方程式 C h i t os a n a qu e ou s s ol u t i onO il ph a s eE m u ls if ic a ti on ( W /O) e m u ls io nHa r de n in g of dr ople tsS e pa r a ti on of pa r ti c le sS ti r or U lt r a s ou n dC r os s li n kin ga g e n t 图 乳化交联法操作流程 壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 7 采用乳化交联法，可以通过控制含水液滴的大小来控制 纳米粒子 的粒径，最终产物纳米粒子 的粒径也取决于在形成乳液时的油相比，交联程度等。 (2)喷雾干燥法 喷雾干燥法是以热气流干燥雾化液滴为基础的。 其操作流程如图。 此法是将壳聚糖溶于酸性溶液中，再将药物溶解或分散于该壳聚糖溶液，加入一定量的交联剂，在惰性的热气流中喷雾干燥，当液体通过蠕动泵输送到喷嘴后，压缩空气将液体雾化为小液滴，液滴与热空气被共同吹入一个腔体中，液滴中的酸迅速蒸发，从而形成壳聚糖含药纳米粒子 [33]。 纳米粒子 的粒径取决于喷嘴的直径，喷嘴流率，雾化压力，入口温度和交联程度等因素 [32]。 He 等 [35]将配置好的壳聚糖水溶液与一定比例的戊二醛水溶液混合均匀，然后进行喷雾干燥，制备出的壳聚糖 纳米粒子 粒径在 312 μm之间。 图 喷雾干燥法操作流程 (3)逐层自组装 逐层自组装法适用于制备球壁厚度可控的空心 纳米粒子。 纳米粒子 的球壳是通过溶质逐层沉降制得的。 通过限制溶质沉降次数可控制空心 纳米粒子 的球壳厚度，除去 纳米粒子 中的核物质即可获得所需的空心结构。 Shao 等 [36]等将聚苯乙烯磺酸钠 /壳聚糖聚电解质溶液吸附于制备好的壳聚糖 纳米粒子 模板表面，经过调节 pH 值，层层沉积后，进一步处理即可得到所需的壳聚糖 纳米粒子 ，如图 所示 [32]。 壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 8 图 逐层自组装反应流程 (4)界面聚合法 界面聚合法是将含有亲水性单体溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有机溶剂中，然后加入溶于该有机溶剂的疏水性单体（多元酰氯，多元硫酰氯，多异氰酸酯等），使两种单体在水 /油界面处发生缩聚反应形成聚合物球壳。 Wang 等在温和的条件下通过界面聚合法一步制备多糖 多肽复合空心 纳米粒子。 先将壳聚糖与 α氨基NCA（ Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再将一定量 L亮氨酸 NCA 分散至乙酸乙酯中，并用 Span80 乳化后与水溶性壳聚糖在一定条件下反应 2 h，经进一步处理可得壳聚糖空心纳米粒子 [32]。 图 界面聚合法反应流程 壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 9 (5)沉淀法 沉淀法是利用壳聚糖不溶于碱性溶液的性质制备 纳米粒子。 制备的方法是将用高压空气将壳聚糖溶液吹入碱性溶液如氢氧化钠，氢氧化钠甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成 纳米粒子 ，如图 所示。 然后用冷热水交替洗涤提纯产物。 另一种操作方法为：在壳聚糖溶液中加入表面活性剂，然后再逐滴加入硫酸钠溶液，搅拌或超声 30 分钟后，离心分离出产物。 此法制备的壳聚糖 纳米粒子 酸稳定性较强 [31]。 图 沉淀法反应示意图 (6)其他制备方法 制备壳聚糖 纳米粒子 的方法还有很多。 溶剂蒸发法又称液中干燥法，常用的溶剂蒸发法是根据聚合物与药物的性质制成乳液体系，形成稳定乳液后，采用升温，减压抽提或连续搅拌等方法使有机溶剂扩散进入连续相并通过连续相和空气的界面蒸发， 纳米粒子 固化，并经过处理最终得到载药 纳米粒子 的过程 [32]。 目前最常用的方法是将壳聚糖醋酸溶液加入含表面活性剂的液体石蜡中，形成 W/O 型乳剂，升温再减压干燥除去溶剂，分离得到壳聚糖 纳米粒子。 Sinha 等 [28]采用此法制备了性质优良的壳聚糖 纳米粒子。 常见的壳聚糖 纳米粒子 制备方法还有离子凝胶法，反胶束法，壳聚糖包裹法和壳聚糖 纳米粒子 乙酰化法等 [33]。 壳聚糖 纳米粒子 的应用 壳聚糖 纳米粒子 在肿瘤治疗方面应用广泛 [33]。 它的应用主要有以下几方面： (1)作为药物载体，可包埋多种类型药物 壳聚糖 纳米粒子 由于其良好的生物相容性，生物降解性和低细胞毒性，被广泛应用于药物载体方面。 所包埋的常见药物有：牛血清白蛋白（ BSA），青霉素，四环素，维生壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 10 素，胰岛素等。 Hejazi 等采用乳化交联法制备了包载四环素的壳聚糖 纳米粒子。 经沙鼠动物实验发现，在酸性环境下的稳定性增加，能够黏附在胃黏膜上。 Jaganathan 等 [37]采用乳化交联法制备了载有破伤风类毒素的壳聚糖 纳米粒子 ，稳定剂海藻糖能够保持抗原蛋白质的活性， 纳米粒子 的包封率也从加入海藻糖前的 40%提高到 90%。 (2)缓控释给药 壳聚糖分子内具有活性基团氨基，可与含双官能团的醛类或酸酐类药物发生化学交联，使药物大量分布于交联结构，缓慢释放，包封在壳聚糖 纳米粒子 内的药物具有明显的缓释，控释特点。 Wang 等制备了壳聚糖胰岛素 纳米粒子 ，其包封率高达 70%，胰岛素的化学稳定性大于 95%，并且胰岛素可以长时间稳定释放。 Chandy 等 [37]制备了壳聚糖包衣的 PLA/PLGA 纳米粒子 ，用于 5氟尿嘧啶的脑胶质瘤的靶向治疗，研究发现所得 纳米粒子 表面孔空隙率低，药物初次突释后呈典型的二相释药，可靶向结合脑胶质瘤，且稳定释放 30 d 以上。 (3)增加药物的靶向性 壳聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通过控制壳聚糖 纳米粒子 的大小，形状，选择适当的给药方法，能够提高壳聚糖 纳米粒子 的靶向效果。 李扬等利用乳化分散法制备了左氧氟沙星羧甲基壳聚糖 纳米粒子 ，体内外试验结果表明所载药物可如预想设计到达结肠定位释放。 (4)降低药物的毒副作用，提高疗效 载有药物的壳聚糖 纳米粒子 循血液循环到达靶区周围释放药物，使靶区周围很快达到有效的治疗药物浓度，而在机体其他部位药物的分布量较小，从而减少了对机体正常组织的毒副作用，同时由于载体壳聚糖本身具有一定的生理活性，且无毒，与药物可产生协同作用增强疗效。 徐海涛等观察了壳聚糖 顺铂缓释 纳米粒子 对 C6胶质瘤大鼠瘤内化疗的疗效，结果表明，壳聚糖 顺铂 纳米粒子 毒性小，安全性较高，疗效可靠。 (5)提高疏水性药物对细胞膜的通透性，增 强细胞吸收 壳聚糖 纳米粒子 溶胀引起的扩散释药过程可以增加药物在吸收部位的浓度梯度，对药物的吸收具有协同促进作用。 同时壳聚糖分子可以改变膜转运机制，打开细胞通道，有利于提高药物在细胞间瞬间渗透的能力，促进药物在细胞内发挥药效。 Mooren 等研究了泼尼松龙磷酸钠壳聚糖 纳米粒子 通过上皮细胞膜的情况，结果表明，壳聚糖 纳米粒子可以改善上皮细胞膜对疏水性药物通透性。 Mitra 等将 Doxorubicin（ DXR）包封于壳聚糖壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 11 纳米粒子 中，不仅肿瘤实体内药物浓度提高，作用维持时间延长，治疗效果改善，不良反应也明显减轻。 (6)提高药物的稳定性 随着生物技术的发展，基因重组肽和蛋白质药物不断涌现，应用于临床的种类也越来越多。 与化学合成药物相比，肽类药物具有毒副作用轻，吸收快的特点，但由于此类药物分子质量大，在体内外的稳定性差，在胃肠道内容易被酶降解，半衰期短，生物利用度极低，临床应用受限制。 壳聚糖属亲水性聚合物，可制得不同大小的 纳米粒子 ，将疫苗，蛋白质，抗生素类药物制成 纳米粒子 系统给药，不仅能有效防止药物在体内的快速降解，提高药物的稳定性，而且还能将药物缓慢释放并靶向送达体内的作用部位，从而达到长效缓释靶向的目的。 Alexakis 等制备了小牛胸腺 DNA海藻酸酯 纳米粒子 ，外面包覆壳聚糖制成载药 纳米粒子 后经过胃肠道时药物不被破坏， 60%DNA可以从粪便等排泄物中得到。 课题的研究意义与创新点 课题的研究意义 恶性肿瘤是严重危害人类生命的疾病。 癌症的化学预防是利用天然的或合成的化合物干预癌前病变，预防肿瘤的发生或使肿瘤细胞分化逆转，从而达到预防恶性肿瘤的目的。 目前癌症化学预防研究的主要目标就是寻找高效低毒，作用机制明确的化学预防药物。 硒代胱氨酸是一种新型高效的抗肿瘤药物，生物活性高，对正常细胞毒性小。 但是研究表明， SeC 不易进入肿瘤细胞，对细胞的渗透性不强。 因此，希望借助纳米药物载体来提高细胞吸收，减少它进入肿瘤细胞的时间。 本文通过乳化交联法制得壳聚糖 纳米粒子 载体负载硒代胱氨酸，并对 MCF7 进行 体外抗肿瘤活性 实验，实验结果表明，壳聚糖能够增强硒代胱氨酸对 MCF7 的细胞毒性，并在较短的时间内起作用。 创新点 通过以 CSNPs 为载体，有效增强 SeC 的体外抗肿瘤活性，并显著缩短 SeC 对 MCF7起作用的时间。 壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其 体外抗肿瘤活性 的研究 12 第二章 空白壳聚糖纳米粒子的制备 实验部分 材料与试剂 表 21 实验试剂 Table 21 Reagents used in experiment 试剂名称 规格 产地 液体石蜡 AR 天津市化学试剂公司 Span80 CP 天津市化学试剂公司 壳聚糖 90 % MW=60000 上海伯奥生物科技有限公司 戊二醛 (25%) AR 天津市百世化工有限公司 甲苯 AR 天津市百世化工有限公司 无水乙醇 AR 天津市百世化工有限公司 石油醚。