工程科技]生物无机化学讲义

工程科技]生物无机化学讲义内容摘要：

态。 目前，从天然及合成的核酸的 X 射线衍射分析还发现有 ADNA、 CDNA、 DDNA 等构型，尽管它们都为双螺旋结构，但它们的结构具有明显不同。 这一发现能够解释许多特征生命现象，引起世界各国科学家的高度重 视。 20 世纪 80 年代，生物无机化学家在研究金属离子与核酸的相互作用机制时，发现某些金属配合物可作为 DNA 的结构探针，用于判别 BDNA 和 Z 型 DNA。 BDNA 的疏水型碱基位于螺旋的内侧，具有亲水性的磷酸二酯键形成多聚核苷酸为主链外侧，由于 ZDNA 中碱基鸟嘌呤的 C8 和 N7 暴露于双螺旋的外侧，受保护程度小，容易受化学致癌剂攻击而引起化学反应，因此， ZDNA 可能与突变、基因表达和调控有关。 DNA 为抗癌药物的重要靶标之一，科学家们已经证实临床顺铂的抗癌机理， 顺伯中的 Pt 原子能够与 DNA 小沟中的同一链上相邻 鸟嘌呤 [dGPG]的 N7 共价结合形成链内加合物，使 DNA 双链解旋并弯曲 ，从而起到抗癌作用。 因此，金属配合物和大分子 DNA 相互作用研究来探索 DNA 的结构与功能，将有助于人们从分子水平上了解生命现象的本质，并从基因水平上理解癌症、遗传病、艾滋病等疾病的发病机理和药物作用机理，从而使通过分子设计寻找有效的治疗药物成为可能。 插入 DNA 的某些配合物 将可 作为人工核酸酶、 DNA 结构探针、 DNA 分子光开关试剂、 DNA 断裂试剂和抗癌药物等。 20 第一节 配合物与 DNA 的作用方式 核酸由平行 堆积 的碱基、聚合的阴离子磷酸 骨架以及两 条有核苷酸链形成的大沟、小沟组成了配合物 分子识别的位点。 小分子与 DNA 的结合常常诱发很多生物效应 ， 这种结合按化学键来划分主要有非共价键结合和共价键结合。 一、非共价结合 非共价结合包括静电力结合、沟内结合和嵌插结合，如图 21 所示。 另外氢键、范德华力、疏水键等弱相互作用使配合物小分子通过沟内或嵌插结合在 DNA的螺旋沟或碱基中，加上静电力作用，会诱导许多生物效应，阻碍核酸信息的正常表达。 图 21 DNA 与小分子的非共价结合的三种模式 (1)外部静电结合 核酸是一个高度带电的聚合电解质，它的阴 离子磷酸根部分强烈地影响DNA 的构象及其反应。 小分子与 DNA 的静电结合即小分子通过非特异性的相互作用结合于带负电的 DNA 双螺旋外部的磷酸骨架，如图 21（ 1） 示。 有些小分子与 DNA 的静电作用队其与 DNA 间的嵌插作用起重要的稳定作用。 (2)沟内结合 很多蛋白质与 DNA 的特异性结合是发生在 DNA 的大沟内，而小分子一般在小沟区作用。 大、小沟区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有很大的不同。 大多数的沟内结合的小分子含有芳香杂环结构如呋喃、吡咯或苯环，这些苯环有扭转自由的键连接着，由此产生合适的扭转力来配 合小沟内螺旋曲线，取代沟区内的水分子并于 DNA 双螺旋链中的沟区的碱基对边缘通过范德华 21 力形成接触，小分子在小沟区结合的特异性也缘于此。 沟内结合的小分子就是这样选择性的作用于 DNA 双螺旋结构中 AT 较为丰富的片段，通过氢键、范德华力等作用，非嵌入性地捆缚住 DNA，从而阻止 DNA的模版复制，起到抗病毒、抗肿瘤的作用。 (3)嵌插结合 嵌插结合是药物分子与 DNA 发生作用的重要形式之一。 它是以平面或几乎平面的芳香杂环嵌入 DNA 的碱基对中如图 （ 3）。 这是芳环的离域π体系与碱基π体系的π π相互作用及疏水作用的结果。 当小分子嵌入 DNA 碱基对后，有的可能抑制 DNA 复制与转录功能，有的则在经过进一步活化后使 DNA 断裂受损而影响其功能。 而且手型配合物与 DNA 发生 嵌插结合 时具有识别 DNA 构型等的能力，如 科学家们 在研究 [Zn(phen)3]2+、 [Co(phen)3]3+和 [ Ru(bipy)2(HNOIP)] 2+等手性配合物 与 DNA 的作用时发现，这类手性金属配合物与 DNA 作用时，只有一个 Phen 插入到 DNA 的碱基对之中，另外的两个 phen 留在 DNA 的双螺旋外，△型 [Zn(phen)3]2+与右手螺旋的 DNA 作用时，未插 入 DNA 的两个 phen 刚好与 B 型 DNA 分子空间匹配；∧型 [ Ru(bipy)2(HNOIP)] 2+的两个 bipy 与右手螺旋的 DNA 的磷酸骨架碰撞，而未能插入 B 型 DNA 中。 当与左手螺旋的 Z 型 DNA作用时，情况刚好相反，∧型配合物优先与其发生嵌插作用，△型配合物由于手性不能匹配，未能插入。 这表明手性配合物对 DNA 作用具有立体选择性分子识别能力，可作为 DNA 二级结构的结构探针。 图 22 手性配合物的分子结构图 二、 共价结合 共价结合包括与 亲核试剂的作用和与亲电试剂的反应。 主要表现为 DNA 的烷基化及 DNA 的链间交联和链内交联等，与非共价结合相比， DNA 靶向分子与 22 DNA 共价结合序列特异性识别能力要强的多。 小分子与特定碱基作用并形成加合物，使 DNA 双链解旋并弯曲。 如顺伯中的 Pt 原子能够与 DNA 小沟中的同一链上相邻鸟嘌呤的 N7 共价结合形成链内加合物，使 DNA 双链解旋并弯曲。 图 23 cis[Pt(NH3)2]离子与 DNA 片段分子 d(GGAGACCAGAGG)（上图）和（ dpGpG）（下图）形成的链内加合物晶体结构 23 第二节 配合物与 DNA 作用的研究手段 为探讨 DNA 与金属配合物间的相互作用及作用机理，许多研究方法和技术被引入此研究领域。 一、 紫外 /可见光谱法 含有碱基生色团的双螺旋结构 DNA 分子，其 UV/Vis 吸收光谱在 260nm 附近有一强吸收峰，当小分子与核酸结合后，对核酸或小分子吸收峰的吸收光谱都会引起变化，可根据相互作用前后 DNA 或其它分子的吸收谱带的变化对金属配合物与作用模式进行判断。 Ⅰ 对于 DNA 的吸收光谱来说，如导致构象变化，则产生减色效应和红移现象，且作用越强减色效应越明显；如导致 DNA 双螺旋结构的破坏，则产生增色效应。 Ⅱ 对于金属配合物等小分子的特征吸收谱带。 当金属配合物嵌插如 DNA 碱基对中，即发生插入作用时，将会发生减色效应，这是因为 DNA 碱基对与插入配体间发生π电子嘴积，使后者的π *空轨道上也有一定的电子填充，从而使MLCT 跃迁的几率减少。 减色效应的强弱，能够反映插入能力的大小，插入能力越强，减色效应越强。 与 DNA 发生插入作用后的配合物，插入配体与 DNA 碱基对间发生π电子堆积后，配合物的配体共轭性加强，产生红移现象，红移程度反映出插入能力的大小。 插入能力强的配合物，红移较大，插入能力弱的配合物，红移较小。 如图 24 所示， 我们课题组合成 的 [Pd(phen)(trp)]Cl5H2O 和 [ Pd (NO2phen)(trp)]Cl5H2O 与 DNA 相互作用的紫外光谱图，配合物与 DNA 发生后发生红移和减色效应，证明与 DNA 发生了嵌插作用。 图 24 [Pd (phen)(trp)]Cl5H2O 及 [Pd(NO2phen)(trp) ]Cl5H2O 与 DNA 作用的紫外光谱图 24 二、荧光光谱法 荧光光谱作为一种快速、灵敏的谱学技术应用于 DNA 与小分子相互作用的研究。 可根据两者相互作用前后荧光强度的变化判断小分子与 DNA 的作用 模式。 溴化乙锭（ EB）是应用最早的荧光探针，被广泛应用于抗癌药物的筛选和小分子与 DNA 作用的研究，它是一共轭平面分子，本身荧光很弱，但能专一地插入DNA 双螺旋或三螺旋内部的碱基对之间，形成 EBDNA 复合物，因而荧光强度大大加强。 当有能与其竞争插入 DNA 的配合物存在时， EB 会被配合物从 DNA中挤出来，而体系的荧光强度减弱。 李志良等报道的荧光 筛 选法标准：如果药物使 EBDNA 体系荧光减弱 50%以上，且药物与 DNA 的物质的量浓度比不超过100，以此为标准，认为药物与 DNA 发生了显著作用。 另外， I和 [Fe（ CN）4]4都是典型的荧光猝灭剂，通过考察它对小分子荧光的猝灭作用可判断小分子与 DNA 的作用方式。 若小分子与 DNA 发生插入结合，带有负电荷的 DNA 磷酸骨架对 [Fe（ CN） 4]4有强烈的排斥作用，因而插入结合的阳配离子受到保护，被[Fe（ CN） 4]4猝灭发光的可能性小。 图 25 为 溴化乙锭的结构图，图 26 为我们合成的钯 (Ⅱ )联喹啉 丙二酸 [Pd(biqu)(mal) ] H2O 与鱼精 DNA 发生嵌插作用的荧光光谱图。 a 为 配合物的荧光光谱， be 为 向配合物的溶液中滴加 DNA的荧光光谱 , 由图可看 出 随 DNA 量的增加，配合物荧光强度逐渐增强，这是由于配合物插入 DNA 后， DNA 碱基对的疏水环境对配合物荧光发光具有保护作用，从而证明配合物与 DNA 发生了 嵌插作用。 N +N H 2N H 2C H 3 C H 2B r 图 25 溴化乙锭的结构图 25 图 26 DNA 对 [Pd(biqu)(mal) ]H2O 荧光光谱的影响 三、圆二色光谱法 圆二色光谱 (CD)以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对构型、构象和反应机理的研究提供了很多信息，是目前研究有机化合物和 生物大分子的构型、构象和三维空间结构强有力的工具，可现场检测构象己知的生物大分子构象变化过程。 CD 谱是 DNA 螺旋构象的非常敏感的指示剂，可给出与 DNA 作用的小分子的某些基团跃迁谱带变化的信息，进而可获得二者键合方式的信息。 一方面根据 DNA 在 260nm 处的吸收提供有关结构信息，另一方面对一些本身没有 CD 信号，但与 DNA 结合后能产生诱导 CD 信号的分子，可获得一定的有关其结构的间接信息。 CD 光谱是研究配合物与 DNA 作用方式的重要方法，根据光谱形状和吸收强弱可以判断 DNA 构型的转变。 图 27 鱼精DNA 及配合物 [Pd(Ltyr)2] /DNA 复合物的 CD 光谱图 ， a 为鱼精 DNA，b、 c 为 配合物 /DNA 复合物的 CD，由图可看出，当向 DNA 溶液中加入配合物后， DNA 的正负吸收均有增加，形状并没有发生变化，因而此化合物主要以插入作用与 DNA 发生了相互作用。 26 图 27 鱼精 DNA 及配合物 [Pd(Ltyr)2] /DNA 复合物的 CD 光谱图 四、黏度法 通常在缺少高精度晶体结构数据和核磁数据时，黏度这种流体力学方法是检测溶液状态下配合物与 DNA 作用方式的有效的重要手段。 当小分子配合 物与DNA 发生插入作用时， DNA 的相邻的碱基对之间的距离会变大以容纳插入型配体，导致 DNA 双螺旋的链增长， DNA 的黏度增加；当配合物以静电或沟面结合等非插入模式与 DNA 作用时， DNA 双螺旋长度基本不变， DNA 溶液的乃浓度也没有明显变化，而当配合物以部分插入方式同 DNA 作用时，会使 DNA 双螺旋扭结，以至于 DNA 双螺旋长度减少，进而导致 DNA 溶液黏度减小。 五、凝胶电泳法 在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电状态的蛋白分子，将向着与其相反的电极移动，这种现象称为电泳。 核酸 DNA 在一定的 PH 值下带有负电荷，在 电场中向正电极移动。 以琼脂糖为支持介质的凝胶电泳广泛应用于分子生物学领域，是定量、分离、鉴定和纯化 DNA 片段的主要方法。 带电颗粒在电场中的泳动速度主要取决于它所带的净电荷量、颗粒的大小和形状。 当带电颗粒在电场中泳动时，受到两种方向相反的力的作用 :电场力，摩擦力，而 DNA 通过琼脂糖凝胶的电泳速率取决于以下 4 个主要参数 : (1) DNA 分子大小线状双链 DNA 分子被认为是以一端向前方移动，它在凝胶基质中的迁移速率与其碱基对数目以 10 为底的对数值成反比，分子越大，越 27 难于在凝胶中孔隙中蠕行，因而迁移得 越慢。 (2)琼脂糖凝胶浓度同样大小的 DNA片段在不同浓度琼脂糖凝胶中迁移速率不同。 因此，利用不同浓度琼脂糖凝胶可以分辨范围广泛大小不同的 DNA 片段。 (3) DNA 构型相同分子量，不同构型的 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率不同。 在 TAE 缓冲液中，迁移速率 :超螺旋 (CCC)线状 (OP)开环 (OC)o (4)应用的电流在低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所用电压成正比。 但是当电场强度增加时， DNA 片段的迁移速率的增大是不同的。 因此，琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。 为了获得 DNA 片段最大的分辨力，凝胶电泳不应超过 5 伏 /厘米。 图 28 为 对DNA 的切割电泳图， M 为 Marker DNA ,1 为纯 pBRDNA ,27 为向 pBRDNA加入一定量后 DNA 谱带的变化。 其中， Ⅰ为超螺带，Ⅱ缺口环化带，Ⅲ线性带。 图 28 对 DNA 的切割电泳图 六、 X射线单晶衍射法 X射线单晶衍射法用于生物大分子的结构。