细胞培养技术修改版

细胞培养技术修改版内容摘要：

数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。 计算细胞浓度。 用 RPMI1640 制备成 1 106/ml 浓度的细胞悬液，并按 10％的量加入小牛血清。 将上述细胞悬液分装 5ml 到新细胞瓶中，塞好塞子，标记后送培养箱培养， 9 24h 后观察。 五、实验结果 显微镜下观察 Hep2 细胞生长良好，已长满单层，细胞呈不规则多边形，透光性良好。 实验五 VSV TCID50滴定 一、实验目的 掌握病毒 TCID50滴定的基本原理和计算方 法以及应用。 二、实验原理 多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（ cytopathic effect， CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。 CPE 的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。 即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量定义为病毒的 50％组织细胞感染指数（ 50％ tissue culture infectious dose， TCID50）。 测定时，首先在微 量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。 将待测病毒用维持液做 10 倍稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的 CPE不再进展为止。 具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般 48h即可； VSV 增殖也较快，因此， 48h～ 72h 也可以观察、染色、计算。 三、实验材料 细胞： Hep2细胞株（实验四传代所得），自备 /组。 病毒：水泡性口炎病毒（ vesicular stomatitis virus， VSV），自备 /组。 试剂：维持液， PBS， VTP 等自备 /组。 材料：细胞板（ 1块 /组）， tip 头（ 2盒 /排），微量移液器， 5ml 或 10ml 吸管（ 2支 /组），青霉素瓶带塞（ 10个 /排），酒精缸，镊子（ 2个 /排） 四、操作步骤 制备细胞：方法同实验四。 一瓶细胞消化后加入营养液制成所需细胞悬液，浓度约为 1 106/ml。 用微量移液器将细胞悬液加入 40孔板微孔中，每孔 100μ l， 10 37℃， 5%CO2孵育箱培养 24h，形成单层后，做病毒滴定用。 50%组织细胞感染量（ TCID50）测定 （ 1）稀释病毒液：取无菌青霉素瓶 9支，各管分别加 3%小牛血清的维持液 ，然后向第一管加 VSV 病毒液 ，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液 加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液 加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续 10 倍稀释，使病毒稀释为 101， 102， 103„ 109。 （ 2）病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的 VSV 病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加 2 孔，每孔 100μ l。 细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。 置 37℃， 5%CO2孵育箱中孵育。 （ 3）结果观察：于孵育 后 1 2 3 4 72h 在倒置显微镜下观察 CPE，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落现象。 “ ”表示细胞正常；“ +” 25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“ 2+” 50%细胞产生病变；“ 3+” 75%细胞产生病变；“ 4+” 100%细胞产生病变。 （实验时，观察 24h~48h 即可染色计算） 计算 TCID50参见下表 表 VSV在 Hep2 细胞上的 TCID50结果记录 病毒稀释度 病变孔数 /接种孔数 累积数（孔） 病变细胞孔 有病变 ↑ 无病变 ↓ 比例 百分比（ %） 103 8/8 10 0 10/10 100 104 2/8 2 6 2/8 25 105 0/8 0 14 0/14 0 106 0/8 0 22 0/22 0 107 0/8 0 30 0/30 0 108 0/8 0 38 0/38 0 按表中， 103稀释的病变高于 50%； 104稀释的病变低于 50%； 50%病变分布于 103与 104之间，计算公式如下： 高于 50%病变率 （ 50%） 10050 距离比例 = lg稀释倍数 = lg10 高于 50%的病变率 低于 50%的病变率 10025 = lg TCID50=高于 50%病变的低稀释度对数 +距离比 =3+()= 即 1 个 TCID50=，查 的反对数为 ，即病毒做 103倍稀释时取 接种细胞，即可使 50%细胞产生病变。 11 附录：如何计算 200 个 TCID50。 103247。 200=，将病毒作 倍稀释时即得 200 个 TCID50。 五、计算 请计算提供的病毒的 TCID50。 六、写实验报告并计算给定的病毒的 TCID50。 实验六 干扰素活性（效价）的测定 （注：此实验所需的细胞为实验四时传代培养所得） 一、实验目的 掌握微量细胞病变抑制法测定干扰素效价的基本步骤以及结果分析。 熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义。 了解影响结果的常见因素。 二、基 本原理 病毒或其他干扰素诱生剂作用于巨噬细胞、 T 细胞或成纤维细胞后，由细胞基因自身编码产生的具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的一类小分子糖肽，统称为干扰素。 干扰素发挥重要的酶的特性而抑制病毒 DNA 和蛋白质的合成，从而抑制病毒在细胞内的增殖。 因此具有间接的广谱抗病毒作用。 为了进一步确定人工方法制备的干扰素的生物学活性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效价的测定。 干扰素效价一般定义为：凡 1ml 干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（ 50％）免受 “ 攻击病毒 ” 损害者，该稀释度的倒数即为干扰素的效价，即单位 /毫升。 三、测定方法 测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是 “ 细胞病变抑制法 ” （ Method of。