第二十五章基因结构分析的基本策略

第二十五章基因结构分析的基本策略内容摘要：

主要有两种方法： •5 ′端连续分析基因表达 （ 5 ′ end serial analysis of gene expression, 5 ′ SAGE） •帽分析基因表达 （ cap analysis gene expression, CAGE） 目 录 (1) 5 ′ SAGE •5′SAGE是在 PCR过程中将 MmeI酶切位点引物 cDNA的 5′端，通过酶切和连接获得不同短片段重复序列，并对重复序列进行测序获得大量片段序列信息 •不同序列的短片段代表不同基因的转录起始点 (TSS) MmeI: •是一种特殊的 II型限制性核酸内切酶 •识别的序列不是回文结构，而是 不对称的 DNA序列 5′TCCRAC3′（ R代表 G或 A） •在识别位点下游 18~20碱基处切开双链 DNA 目 录 Gppp AAAAAAAAn mRNA 用 BAP和 TAP处理 AAAAAAAAn p 在 RNA的 5端加上寡核苷酸帽 AAAAAAAAn 5 XhoI MmeI 反转录酶 RT 5 AAAAAAAAn 5 cDNA PCR Biotin标记引物 随机引物 5 5 Biotin MmeI 酶切消化 5 20 mer 5 Biotin 亲和素 用亲和素 生物素，可以将 5端 片段与其他片段分离开 目 录 5 20 mer 连接 5 Biotin 5 Biotin 5 20 mer PCR扩增 5 5 Biotin 5 Biotin 5 XhoI 酶切消化 自身连接 串联体 测序分析 目 录 (2) CAGE CAGE与 5′SAGE非常相似 所不同的是 : •CAGE不需要在 RNA上加接头 ， 而是用 oligo(dT)引物先进行第一链 cDNA的合成 •然后通过捕获帽结构，将含有 MmeI和另一内切酶位点如 XmaJI的 linker加到单链全长 cDNA的3′末端 目 录 AAAAAAn Cap mRNA 反转录酶 Oligo (dT)15~18 AAAAAAn Cap TTTTTTTn cDNA 捕获 5帽结构 单链 linker 连接 TTTTTTTn Biotin cDNA第二链的合成 TTTTTTTn AAAAAAn MmeI XmaJI MmeI 酶切 亲和素 20 mer 用亲和素 生物素，可以将 5端片段与其他片段分离开 目 录 连接第二个 linker XbaI XmaJI XmaJI, Xbal 酶切消化 PCR（用 linker1和 linker2作引物） Linker 1 Linker 2 纯化，串联连接，克隆 20 mer XmaJI和 XbaI是同尾酶： XmaJI： C^CTAGG XbaI： T^CTAGA 串联体 测序分析 目 录 第三节 启动子的结构及功能分析 目 录 主要内容： 一、启动子的结构分析 二、启动子的功能分析 目 录 启动子（ promoter） •是一段能被蛋白质识别的、参与特定基因转录调控的 DNA序列 •II型启动子通常位于结构基因的上游 •共通序列 (consensus sequence)是其特征性序列 •共通序列和启动子所处的位置是研究启动子的重要线索 目 录 +10 +20 Start site 10 20 30 40 +1 ATG 3 +5 Initiator 共通序列 例如： •原核基因的共通序列： 10区： Pribnow box（ T77A76T60A61A56T82序列） 35区： T69T79G61A56C54A54 序列 •真核基因的共通序列： 真核基因启动子在 50区域附近 （ 大约 5%~30%基因启动子在 25~30区域 ） 有 TATA box（ TATAAA序列 ） TATAAT TTGACA 目 录 一、启动子的结构分析 主要方法： •利用 PCR技术克隆启动子 •利用核酸 蛋白质相互作用方法研究启动子 •生物信息学预测启动子 目 录 （一）利用 PCR技术克隆启动子 特异性基因序列 基因上游序列 基因组 DNA 根据基因序列合成一条反向引物 正向引物用随机引物 PCR扩增 随机引物 特异引物 克隆及测序分析 注意： •真核基因有内含子 ， 应该根据 mRNA序列设计特异性引物 •特异性引物尽可能靠近基因的 5端 1. 根据已知基因序列直接进行 PCR扩增 目 录 2. 利用 TSS钓取启动子 AAAAAAn Cap 5 mRNA 反转录 AAAAAAn TTTTTTn cDNA 插入载体，克隆扩增 Cap 5 以基因特异引物与载体引物配对 PCR扩增 5 测序分析基因转录起始点序列 以 TSS序列为引物，基因组序列为模板，与随机引物配对进行 TSS上游序列的 PCR扩增 目 录 3. 利用环状 PCR钓取启动子 基因组 DNA 酶切消化 基因组 DNA片段 直接环化连接 加上接头后环化连接 根据基因上游序列设计一对反向互补引物 PCR扩增 根据接头序列设计引物 PCR扩增 克隆 测序分析 克隆 测序分析 •加接头环化 PCR不依赖特异基因序列 •可用于筛选启动子 接头 目 录 （二）利用核酸 蛋白质互作方法研究启动子 •启动子是一段能被蛋白质识别和结合的 DNA序列 ， 因此 ， 能够检测核酸 蛋白质相互作用的研究方。