台州市科技计划项目可行性报告(编辑修改稿)

台州市科技计划项目可行性报告(编辑修改稿)内容摘要：

实验主要仪器设备 暗房中的设备主要包括：荧光显微镜 1 台、图像采集分析系统 1 个、办公电脑 1 台；FISH 操作间主要的设备包括：普通光学显微镜 1 台、 漩涡混合器 1台、电热恒温培养箱 (42℃ )1台、烤片机 1 台、恒温水浴箱 3 台、迷你离心机 1 台、 20℃冰箱 1 台、 4℃冰箱 1 台、 μ l 移液器 1 支、 l 移液器 1 支、 220μ l 移液器 1 支、 20200μ l 移液器 1 支、 2001000μ l 移液器 1 支。 实验所用耗材 实验耗材包括：载玻片、一次性手套、一次性口罩、吸水纸、玻璃刀、铅笔、记号笔、镊子、止血钳、 EP 管、 10μ l 加样头、 20μ l 加样头、 1000μ l 加样头、医疗废物盒、封口膜、15ml 离心管、立式染缸 (考普林瓶 )、 EP 管架、计时器、 水银温度计。 实验所用试剂及配制要求 20 SSC， PH 氯化钠 88g，柠檬酸钠 44g，去离子水 400ml，充分溶解，室温下 12ml HCL 调节 PH 值至 ，用去离子水定容至 500ml,高压灭菌。 使用期间 28℃储存。 保存期不要超过 6 个月， 若试剂出现混浊或污染应丢弃。 2 SSC， PH 177。 20SSC(PH )100ml，去离子水 800ml，充分混匀，室温下 10M NaOH 调节值至 PH 177。 ，用去离子水定容至 1L。 使用期间 28℃储存。 试剂配制 6 个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 变性液： 70%(v/v)甲酰胺 /2 SSC 甲酰胺 35ml， 20SSC(PH )5ml，充分混匀，室温下调节溶液 PH值至 ，用去离子水定容至 50ml。 使用期间 28℃储存。 若试剂出现混浊或污染应丢弃。 试剂配制 7 天后或用于 20 张玻片杂交后应丢弃。 乙醇溶液 (70%乙醇、 85%乙醇 ) 将 700ml、 850ml 无水乙醇用去离子水分别稀释至 1L，使用期间 28℃储存。 试剂配制1 个月后或用于 20 张玻片杂交后应丢弃，若 试剂出现混浊或污染应丢弃。 甲酰胺洗涤液： 50%(v/v)甲酰胺 /2 SSC 甲酰胺 75ml11， 20SSC(PH )15ml，充分混匀，室温下调节溶液 PH值至 ，用去离子水定容至 150ml。 使用期间 28℃储存。 若试剂出现混浊或污染应丢弃。 等量分装至三个考普林瓶，分别标记为“ 1”、“ 2”和“ 3”。 试剂配制 7 天后或用于 20 张玻片杂交后应丢弃。 %NP40/2 SSC 洗液 PH 177。 20SSC(PH )40ml， NP40 ，去离 子水 300ml 充分混匀，室温下 10M NaOH 调节值至 PH 177。 ，用去离子水定容至 400ml。 使用期间 28℃储存。 试剂配制 6 个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 胶原酶 B(’ s BBS) 称取胶原酶 B(SIGMA， C6885)用 5ml Hank’ s BBS 液溶解， 37℃搅拌溶解 1 小时， 4℃过夜，滤过消毒， 20℃分装储存 . 固定液 (甲醇：冰醋酸体积比 3： 1) 量取 30ml 甲醇和 10ml 冰醋酸，充分混合。 使用前新鲜配制 . KCL 低 渗溶液 ( KCL) KCL ，去离子水 300ml，用去离子水定容至 500ml， 28℃储存。 试剂配制 1 个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 100μ g/ml 的 RNase A 配制 RNase A 储存溶液溶解 (1mg/ml)：溶解 于 1ml2 SSC(PH )中，煮沸 10 分钟，冷却至室温， 20℃分装储存。 配制 RNase A 工作溶液 (100μ g/ml)取储存溶液：取 100μ lRNase A 储存溶液 (1mg/ml)于 900μ l 2 SSC(PH )中，混匀， 20℃分装储存。 20mg/ml 的胃蛋白酶储存溶液 溶解 20mg/ml 胃蛋白酶 (Sigma P7000)于 1ml 无菌水中，煮沸 15 分钟，冷却至室温， 20℃分装储存。 1M HCL 浓 HCL ，去离子水 80ml，用去离子水定容至 100ml，室温储存。 试剂配制 1 个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 HCL 取 1M HCL，加去离子水定容至 40ml。 本实验所用 CSP3/CSP7 探针包含 2 种 DNA 探针 ，在中期染色体与间期核上均能杂交产生明亮的信号。 探针名称为 7 号染色体着丝粒。 CSP3 探针杂交信号位于人类 3 号染色体，覆盖整个着丝粒区域，荧光信号为绿色 (FITC)，绿色荧光物质为细胞绿，激 发波长 504nm，发射波长 532nm。 CSP7 探针杂交信号位于人类 7 号染色体 ，覆盖整个着丝粒区域，荧光信号为橘红色 (Rhodamine)，橘红色荧光物质为四甲基罗丹明，激发波长 546nm，发射波长 576nm。 探针杂交到人类中期细胞染色体的荧光信号，敏感性达到 98%以上。 CSP7 DNA 探针杂交到人类 7 号染色体着丝粒 ()的荧光信号，特异性达到 98%以上。 CSP3 DNA13 探针杂交到人类 3 号染色体着丝粒 ()的荧光信号，特异性达到 98%以上。 探针与非目的染色体无交叉杂交反应。 FISH DNA 探针 (20℃避光 ,保存期 1 年 )、杂交缓冲液 (20℃，保存期 1 年 )、 DAPI 复染剂 (20℃避光，保存期 1 年 )、封片胶 (4℃避光保存 )、无水乙醇 (室温保存 )、去离子水 (室温保存 期 7 天 )。 其中 FISH DNA 探针、杂交缓冲液及 DAPI 复染剂均由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。 3 留取尿液标本 留取清晨初次尿液 50ml500ml， 1 小时内送检。 需注意：尿标本要新鲜，取后立即送检(1h 内 )。 放置时间过久尿中成分可发生变化，出现细胞溶解。 容器应清洁、干燥，最好为一次性使用，有较大开口便于收集，防止污染。 尿标本要防止月经血、白带、精液、前列腺液、粪便、烟灰等异物混入。 有明显标记。 如病人姓名、住院号、收集日期等并须粘贴在容器上。 单次收集的细胞数目达不到要求，可以将尿液处理到固定液，多次收集 尿液标本后，混合在一起滴片来满足细胞数目的要求。 4 FISH 操作前为尿液或膀胱冲洗液中的细胞进行样本玻片制备及预处理过程 收集晨尿 50500ml，用 50 ml 离心管离心 (12001400RPM 离心 1015 分钟 )，去清，加样，再离心直到沉淀物足够滴片。 去上清，用 ml 胶原酶 B 重新吹打悬。