世界卫生组织人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册第五版

世界卫生组织人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册第五版内容摘要：

g/ml 精液密度在 和 g/ml 之间 (Huggins 等 , 1942。 Brazil 等 , 2020a。 Cooper 等 , 2020))。 注： 空样本容器可能具有不同的重量，所以每一容器必须提前分别称重。 用不退色标记笔在容器上标明或粘贴标签标识 其重量。 如粘贴标签标识其重量，应在称重前即粘贴标签。 此外，可以直接测量精液体积。 将精液直接射入广口带有刻度的锥形底量筒中，器材均可从市场上购得。 从量筒上直接读取数值（精确到 ml）。 注： 不推荐用移液器或是注射器从标本容器中吸取样本然后注入量筒中测量体积，因该方式无法保证不损失样本，而这会导致对体积的低估。 该法导致的体积损失量在 （ Brazil 等， 2020a； Iwamoto等， 2020； Cooper 等 , 2020）。 注释 1： 低精液体积是生殖道梗阻或先天性双侧输精管缺 如（ CBAVD） (de la Taille 等 , 1998。 Weiske 等 , 2020。 Daudin等 , 2020。 von Eckardstein 等 , 2020)的特征。 同时也可能是精囊发育不良的一个表现。 注释 2： 低精液体积也可能是在精液收集过程中产生了问题（如损失了部分精液），也可能为部分逆行射精或有男科缺陷。 注释 3： 高精液体积可以反映附属性腺分泌旺盛，可能存在活动炎症的情况。 参考值下限 精液体积的参考值下限为 ml（ 95%置信区间（ CI）， ）。 精液 pH值 精液 pH值主要反映出由精囊腺分泌的碱性液体和由前列腺分泌的酸性液体之间的平衡情况。 应在精液液化 30分钟后进行，无论如何不要超过 1个小时，以免因 CO2 丢失而影响检测结果，正常情况下选用范围在。 均匀搅拌样本 (见框 )。 将一滴精液在 pH试纸上均匀展开。 等待浸湿区域的颜色均匀一致（等候时间＜ 30秒）。 与标准带比色读出其 pH值。 注： pH试纸的准确性应该按照已知标准进行检测。 对于粘稠的样本，可取小份样本用专为测量粘稠溶液设计的 pH量尺进行检测。 (Haugen 和 Grotmol, 1998)。 参考值 对于生育男性精液 pH值 的参考值 尚 未 确定，现保持原有下限值。 注释 1： 如低体积低精子数目的精液样本的 pH低于 ，可能存在生殖道梗阻 或先天性双侧输精管缺如（ CBAVD） (de la Taille 等 , 1998。 Weiske 等 , 2020。 Daudin等 , 2020。 von Eckardstein 等 , 2020)。 同时也可能是精囊发育不良的一个表现。 注释 2： 精液的 pH值 如 随时间推移而升高，可能是由于自然缓冲物减少，所以高pH值不能提供有价值的临床信息。 显微镜初检 建议使用相差显微镜对所有未染色的新鲜精液标本进行检查，初检的总放大倍数为 100 倍（即物镜 10179。 和目镜 10179。 ），对标本进行一般观察包括： 粘液丝； 精子凝集； 非精子细胞包括：上皮细胞、圆形细胞（白细胞和未成熟精子细胞）及断裂的精子头部或尾部，这应在总放大倍数为 200或 400倍的条件下进行； 评估精子活力 (见 )； 根据精子计数要求决定稀释倍数 (见 )。 充分混匀精液和取样 充分均匀液化的精液本身就有利于解决化验取样是误差的问题，如样 本不够均匀，观察同一份精液制备两份标本有关精子活动、活力、密度及形态等结果时可能出现明显偏差，为了给生育力的评估提供可靠资料，在检测前，精液样本必须充分混匀 (见框 )，两等份的数值必须相符才可接受测量结果。 两份标本经泊松分类的精子数目（见框 ，表 ）和其百分率的二项分布（见框 ，表 ）需要一致。 框 充分混匀精液： 在取微量样本进行检测前，样本必须在容器内充分混匀，力度要轻柔以免气泡产生，可通过向样本中插入一个宽孔（直径接近 ）的一次性无菌塑料吸液 管抽吸 10次来达到混匀标本的目的。 不可用高速涡旋器，以免对精子造成损伤。 湿片的制作 充分混匀精液样本（见框 )； 混匀后立即取样，以免精子在悬液中沉淀； 再次取样前还需进行混匀，进行分析检查时精液体积和盖玻片的尺寸必须标准化，以保持精子在固定厚度约 20181。 m条件下自由游动将 10181。 l 的定量精液滴在干净载玻片上； 盖上 22mm179。 22mm的盖玻片，形成近 20181。 m厚度，盖玻片的重量使标本均匀展开； 应注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡； 对新制成的湿片，等到玻片上界面不再晃动时应尽快进行检测。 框 湿片的厚度： 涂片的厚度（ D181。 m）是样本的体积（ V， 181。 l =mm3）除以它的液面宽度（ A，mm2）： D=V/A。 如，体积为 10181。 l 的精液置于一张洁净的载玻片上，加盖面积为22mm179。 22mm的盖玻片（面积为 484 mm2），则其厚度应为 ；若体积为 的样本上加盖一张 18mm179。 18mm的盖玻片（面积为 324 mm2），则其厚度为；如体积为 11181。 l 的样本上加盖一张 21mm179。 26mm的盖玻片（面积为 546 mm2），则其厚度为 ；偶尔会出现大厚度的情况，如 40181。 l 的样 本上加盖一张 24mm179。 50mm的盖玻片（面积为 1200 mm2），则其厚度为 ； 注 1： 涂片的深度小于 20181。 m会限制精子的旋转运动 (Le Lannou 等 , 1992。 Kraemer 等 , 1998) 注 2： 如厚度过大 ， 则会因为精子在视野中来回运动而难以进行精子评估。 注 3： 如每一视野中精子的数目差异过大，则样本可能是不具有代表性的。 如出现此种情况则应重新充分混匀精液标本（见框 ）并按照上述步骤重新制备一张涂片。 注 4： 欠缺代表性也可能会导致粘稠度和液化的异常（见 ），精子的聚集（见 ）或精子的凝集（见 ）。 精子聚集 不活动精子之间、活动精子与粘液丝之间、非精子细胞成分或细胞碎片等粘在一起，为非特异性聚集（图 ），这种情况应如实记录。 图 精液中精子的非特异性聚集 图示为精子与上皮细胞（ a），细胞残渣（ b）及精子（ c， d）的聚集现象。 显微图像由 C Brazil提供 精子凝集 精子凝集是指活动精子以不同方式，头对头、尾对尾或混合型，如头对尾，彼此粘在一起。 剧烈震荡会使精子活力过度表现，但有时由于凝集会限制精子的活动力。 任何 精子的头部，尾部或中段有粘附现象都应如实记录。 凝集的类型（反应其程度（ 14级））和吸附状态（ AE级）也应记录（ Rose 等 , 1976）（见图 ）。 一级：轻度聚集指每个凝块中少于 10条精子； 二级：中度聚集指每个凝块有 10到 50条精子，精子运动自如； 三级：大片聚集指 每个凝块有多余 50条精子，精子仍然运动自由； 四级：整个精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互连接。 又可分根据程度又可分 a b c d。 注： 运动的精子粘附于细胞，细胞碎片或是非运动的精子（聚集）应该记为凝集。 图 表 涉及部分 聚集等级 完全分离 聚集精子数＜ 10个， 多数精子为游离状态 中等聚集 聚集精子数 10~50个， 有游离精子 高度聚集 聚集精子数＞ 50个， 部分精子游离 完全聚集 所有精子均聚集一团，无游离精子 1． 轻度聚集指每个凝块中 少于 10条精子； 2． 中度聚集指每个凝块有 10到 50条精子，精子运动自由； 3． 大片聚集指 每个凝块有多余 50条精子，精子仍然运动自由； 4． 整个精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互连接。 A． 头对头 B． 尾对尾 C． 尾端对尾端 D． 混合型 E． 纠结型 注释 1： 存在凝集并不能充分证实为不育的免疫性原因，但是能够说明有抗精子抗体的存在；还需进一步检查以明确诊断（见 ）。 注释 2： 严重的精子凝集能够影响对精子活力和密度的评估。 其他非精子细胞成分 精液中常含 有一定的非精子细胞成分，部分与临床关系密切。 通常包括泌尿生殖道 上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞，后两种统称为“圆细胞” (Johanisson 等 , 2020)。 这些细胞成分在染色后的涂片中（放大 1000 倍）难以区别 (见 节 , 表 13 和 14,以及 节 )。 可以通过过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗原技术来进行鉴别。 非精子细胞成分计数用与精子相同的方法进行，或根据染片 (见 节 )中生精细胞或白细胞与精子的比例来进行计算。 （山东中医药大学第二附属医院生殖中心 董乾 江苏无锡妇幼保健院生殖中心 王洪华） 精子活力分析 精子活力程度与妊娠率有关，电脑辅助法评估精子的运动性见第 节。 精子活力评估应在精液样本液化后尽快（最好在 30 分钟之内）进行，务必在射精后 1 个小时之内进行。 防止时间过长，因脱水、 pH 值及温度的变化对评估结果 产生的负面影响。 过程如下： 178。 将精液样本混匀。 178。 拌匀后立即（防止精子沉淀）取出一等份。 178。 重新搅拌精液样本的剩下部分，取出另一等份。 178。 将上面的两份样本分别滴大约 20181。 m深的湿制剂（见 节）的载玻片上。 178。 等到样本停止悬浮（ 1 分钟以内）。 178。 用 200 或者 400 倍率的相差显微镜观察载玻片。 178。 每个标本大概评估 200 个精子左右，以便算出各自不同类型精子的百分比。 178。 若标本的观察值在可接受的范围，记录下数据， 否则重新制作标本。 注 1： 该过程应该在室温或者显微镜载物台预先加热至 37℃ 的标 准试验室内进行，如果在 37℃ 下进行评估，精液样本需要放置在 37℃ 环境中一段时间，并且制作标本的载玻片、盖玻片也应该预热至 37℃。 注 2： 建议采用带有网格标线的目镜以便选择观察区域，先数积极运动型精子数量，然后数非积极运动型精子数量，最后评估完全不动型精子数量。 （见 节）。 精子活力分类 建议采用一个简单的精液运动分类方法，该方法根据精子运动功能的不同分成以下几类： 178。 运动活跃型（ PR）：精子运动活跃、线性运动或者在较大的范围内运动（不考虑运动的速度）。 178。 非运动活跃型 (NP)：精子运 动但不活跃，如精子在较小的范围内运动，精子头部轻微移位或尽有鞭毛摆动。 178。 完全不动型（ IM） ： 精子完全不动。 注 1： 该手册之前的版本介绍的分类方法将积极活跃型根据精子运动速度的快慢进行细分，如将在 37℃ 下精子运动速度大于 25 微米 /秒的定义为 A 等，这种方法存在的不足之处是实验人员很难客观准确的判断观察到的精子运动到底该归到哪一等。 注 2： 当讨论精子活动率时，细分精子的总能动性（ PR+NP）和活跃精子能动性（ PR）非常重要。 精液样本的准备和评估 如果在 37℃ 的温度下评估，提前 10 分钟开启恒温箱 ，以确保温度恒定在37℃。 准备 20μm深的计数板（见 节）。 用 200 或者 400 倍率的相差显微镜观察载玻片。 等到样本停止悬浮。 在离盖玻片至少 5μm 的区域内观察精子的运动（盖玻片边缘的精子运动性受到干燥物质的影响）。 系统性地观察载玻片以防止重复观察同一个区域，不断改变观察区域，避免基于精子活动数量多少来选择观察区域（观察区域选择应该随机）。 计数开始时间的选择应该随机，计数要迅速，不要等到精子游到所选区域后才开始计数。 评估所选区域的所有精子的活动率，区域选择最好通 过目镜标线来确定，选择区域的大小应根据精液的浓度，如当精液浓度较大时，选择最上面一排网格，浓度低时，选择全部的网格。 计数应该迅速，避免运动精子的数量估计值比实际值多，快速计数网格内的精子，避免因计数时间过长，将计数时游进网格的活动精子也计算入内而导致估计值多于实际值。 首先数所选区域内的运动活跃型精子（ PR），然后是非运动活跃型精子（ NP），最后是完全不动型精子（ IM）。 根据经 验，也可以同时计数一个网格内的三种类型的精子然后再数另一网格内 的三种类型的精子，直到将所选区域数完。 通过实验室计数器 的辅助完成计数。 每个标本至少在 5 个不同的区域计数，所数的精子总数应该不低于 200 个以避免小样本错误。 分别计算两个标本的 PR、 NP 和 IM 比例，然后计算各自的均值和差值。 将计算的结果对照表 （在 95%的置信区间内，在某一均值下，两个比例差 距 可接受的最大值）。 参照表 若两个比例差值在可接受范围之内，记录 PR、 NP 和 IM 比例的 均值，若差值过大，超过可接受范围，重新制作 2 个精液标本。 通过四舍五入 记录 PR、 NP 和 IM 比例均值的整数值。 注 1： 仅计数完整的精子（有头部和尾部，见 节）不要计数只能看见小部分的精子。 注 2： 活性精子计数时往。