植物组织培养技术辽宁职业技术学院

植物组织培养技术辽宁职业技术学院内容摘要：

换，刀口要保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。 ４．解剖针 解剖针用于深入到培养瓶中， 转移细胞或愈伤组织。 也可用于分离微茎尖的幼叶。 第三节 培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组培苗的生长和发育。 一、 温度 温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在 23～ 27℃之间进行，很多研究者采用了 25177。 ２℃的恒温条件。 低于 15℃时培养，组织会表现生长停止，高于 35℃时对生长不利。 但是，不同植物培养的适温不同。 百合的最适温度是 20℃、月季是 25～ 27℃、番茄是 28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。 如烟草芽的形成以 28℃为最好， 在 12℃以下， 33℃以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在 30℃下再生 的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在 25℃下的高。 桃胚在 2～ 5℃条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培养成活率。 用 35℃处理草莓的茎尖分生组织 3～ 5天，可得到无病毒苗。 二、光照 组织培养中光照也是重要的条件之一， 主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： 1．光照强度 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响， 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。 一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2．光质 光质对愈伤组织诱导，培养组织的 增殖以及器官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，８周后，分化出愈伤组织。 但在蓝光下， 几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种 15 天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 3．光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养， 最常用的周期是 16小时的光照， ８小时的黑暗，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织， 在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养， 尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。 如红花、乌桕树的愈伤组织。 三、湿度 湿度的 影响包括培养容器和环境的湿度条件， 容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。 前者又受琼脂含量的影响。 在冬季应适当减少琼脂用量， 否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基， 导致生长发育受阻。 封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭度较高的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发， 一般要求７０～８０％的相对湿度， 常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。 湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高 ,进而影响组织培养的正常进行；过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。 三、渗透压 培养基中添加的盐类、 蔗糖、甘露醇及聚乙二醇类高分子化合物，影响到渗透压的变化。 １～２个大气压对生长有促进作用，２个大气压以上就对生长有阻碍作用， ５～６个大气压生长就完全停止，６个大气压细胞就不能生存。 四、 pＨ值 不同的植物对培养基最适 pＨ值的要求也是不同的（表 2１），大多在５～６ .５左右，一般培养基皆掌握在５ .８，这基本能适应大多植物培养的需要。 表 2１ 不同植物的最适 pＨ值 种 类 最适 PH 值 种 类 最适 PH 值 杜 鹃 4． 0 月 季 5． 8 越 桔 4． 5 胡萝卜、石刁柏 6． 0 蚕 豆 5． 5 桃 7． 0 番茄、葡萄 5． 7 pＨ值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。 以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样， 后者较高一些。 一般来说当ＰＨ高于６ .５时，培养基全变硬；低于５时，琼脂不能很好地凝固。 因为高温灭菌会降低 pＨ值（约０ .２～０ .３个 pＨ） 因此在配制时常提高 pＨ值０ .２～０ .３单位。 pＨ值大小调整可用０ .１Ｍ的Ｎ aＯＨ和０ .１Ｍ的ＨＣ l来调整。 １ ml的Ｎ aＯＨ可使 pＨ值升高０ .２单 位，１ ml 的 HCL 可使值降低０ .２单位。 调节时一定要充分搅拌均匀。 五、气体 氧气是组织培养中必需的因素， 瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。 固体培养基可加进活性炭来增加通气度 ,以利于发根。 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。 本章小结 1．植物组织培养实验室一般由洗涤室、配置室、接种室和培养室构成。 其中，接种室是一个最为重要的操作室。 2．植物组 织培养常用的设备和器材有：玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿等；器械用具，如镊子、剪刀、解剖刀、解剖针等；仪器设备，如超净工作台、冰箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、烘箱等。 3．温度、光照、氧气、 PH、湿度都会影响到组织培养成功率，因此，实际培养外植体时，要根据不同的植物材料，将上述因素调整到适宜的范围。 复习思考题 1．因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些组成部分。 各部分的作用是什么。 2．常规组织培养时，需要什么设备和器械。 你是否会用。 3．组织培养中， PH 有什么作用。 如果 PH 过高或过低会有什么后果。 AAAA4．谈谈组织培养中如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度。 第三章 培养基 目的要求： 1．一般掌握培养基的种类、特点和各自的作用 2．掌握基本培养基的配方 3．一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量 4．掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤 5．熟练掌握培养基的分装和灭菌方法 6．一般掌握培养基的筛选办法 培养基是植物组织培养的重要基质。 在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。 因此，没 有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。 在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。 对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，取得越来越多的成功。 一、培养基的种类 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。 培养基的产生最早是Ｓ acks(1680)和Ｋ nop(1681)，他们对绿色 植物的成分进行了分析研究， 根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Ｓ acks 和Ｋ nop 溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。 以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基， Ｗ hite 培养基在四十年代用得较多，现在还常用。 而到 60 和 70年代则大多采用ＭＳ等高浓度培养基， 可以保证培养材料对营养的需要， 并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入 ,也不致影响培养基的离子平衡。 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。 多数以发明人的名字来命名， 如Ｗhite 培养基 ，Ｍ urashige 和Ｓ koog 培养基（简称ＭＳ 培养基），也有对某些成分进行改良称作改良培养基。 目前国际上流行的培养基有几十种。 常用的培养基及特点如下： １．ＭＳ培养基 它是 1962 年由Ｍ urashige 和Ｓ koog 为培养烟草细胞而设计的。 特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。 其养分的数量和比例较合适， 可满足植物的营养和生理需要。 它的硝酸盐含量较其它培养基为高， 广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。 有些培养基是由它演变而来的。 ２．Ｂ 5培养基 是 1968 年由Ｇ amB 等为培养大豆根细胞而设计的。 其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。 从实践得知有些植物在Ｂ 5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 ３．Ｗ hite 培养基 是 1943 年由Ｗ hite 为培养番茄根尖而设计的。 1963年又作了改良，称作Ｗ hite 改良培养基，提高了Ｍ gＳＯ 4 的浓度和 增加了硼素。 其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。 ４．Ｎ 6培养基 是 1974 年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 其特点是成分较简单，ＫＮＯ 3 和（ＮＨ 4） 2ＳＯ 4含量高。 在国内已广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养和其它组织培养。 ５．ＫＭ－８Ｐ培养基 它是 1974 年为原生质体培养而设计的。 其特点是有机成分较复杂。 它包括了所有的单糖和维生素。 广泛用于原生质体和融合体的培养。 常用培养配方如下： 表 3－ 1 MS 和 White 培养基配方表 有机物 ＭＳ (毫克 /升 ) Ｗ hite (毫克 /升 ) ＮＨ 4ＮＯ 3 １６５０ ＫＮＯ 3 １９００ ８０ Ｃ aＣ l2 ２Ｈ 2Ｏ 4４０ Ｍ gＳＯ 4 ７Ｈ 2Ｏ ３７０ ７２０ Ｋ H2ＰＯ 4 １７０ Ｆ eＳＯ 4 ７Ｈ 2Ｏ ２８ .７ Ｎ a2ＥＤＴＡ ３７ .３ Ｍ nＳＯ 4 Ｈ 2Ｏ ２２ .３ ７ Ｚ nＳＯ ４ ７Ｈ 2Ｏ Ｃ oＣ l2 ６Ｈ 2Ｏ Ｃ uＳＯ 4 ５Ｈ 2Ｏ ０ .０３ Ｎ a2Ｍ oＯ 4 ２Ｈ 2Ｏ 0． 25 H3BO3 ＫＩ ０ .８３ ０ .７５ 烟酸 (Vpp) ０ .５ ０ .５ 盐酸吡多醇 (VB6) 0． 5 0． 1 盐酸硫胺素 (VB1) ０ .１ ０ .１ 肌醇 100 甘氨酸 2 3 二、培养基的成分 培养基的成分主要可以分水、 无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。 １．水 水是植物原生质体的组成成分， 也是一切代谢过程的介质和溶媒。 它是生命活动过程中不可缺少的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。 大规模生产时可用自来水。 但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成份的变化引 起不良效果。 ２．无机元素 大量元素，指浓度大于 ，有Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｃ a、Ｍ g、Ｓ等。 其作用是： (1)氮 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分， 是生命不可缺少的物质。 在制备培养基时以硝态氮和铵态氮两种形式供应。 大多数培养基既含有硝态氮又含铵态氮。 铵态氮对植物生长较为有利。 供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾等。 有时，也添加氨基酸来补充氮素。 (2)磷 是磷脂的主要成分。 而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。 磷也是ＡＴＰ、ＡＤＰ等的组成成分。 在植物组织培 养过程中， 向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对Ｎ的吸收， 增加蛋白质在植物体中的积累。 常用于培养基的磷化物有ＫＨ 2ＰＯ 4 或Ｎ aＨ 2ＰＯ 4等。 (3)钾 是植物营养Ｎ、Ｐ、Ｋ之一。 Ｋ对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。 Ｋ增加时，蛋白质合成增加， 维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。 但浓度不易过大，一般为１～３ mg/l 为好。 制备培养基时，常以ＫＣ L、ＫＮＯ 3 等盐类提供。 (4) Ｍ g、Ｓ和Ｃ a Ｍ g是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；Ｓ是含Ｓ蛋白质的组成成分。 它 们常以Ｍ gＳＯ 4 7Ｈ 2Ｏ提供。 用量为１～３ mg/l较为适宜； Ｃ a 是构成细胞壁的一种成分，Ｃ a对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以Ｃ aＣ l2２Ｈ 2Ｏ提供。 (5)微量元素 指小于 ， Ｆ e、Ｂ、Ｍ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o等。 铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。 同时， 它又是叶绿素形成的必要条件。 培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 在制做培养基时不用Ｆ e2（ＳＯ 4） 3和Ｆ eＣ l3 （因其在 pH５ .２以上，易形成Ｆ e（ＯＨ） 3的不溶性沉 淀），而用 Ｆ e ＳＯ 4７Ｈ 2Ｏ和 Ｎa2ＥＤＴＡ结合成螯合物使用。 Ｂ、Ｍ n、Ｚ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o 等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，分裂异常。 总之，植物必需营养元素可组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质。 也可构成一些特殊的生理活性物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，参与活跃的新陈代谢。 此外，还在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学。