微生物发酵工程实验指导

微生物发酵工程实验指导内容摘要：

，显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、解剖针、酒精灯、镊子、培养皿 等。 四、操作步骤 （一）甜酒酿的制作 酒 药 洗米 蒸饭 淋水 降温 落缸搭窝 发酵 甜酒酿 浸米与洗米：选择优质新鲜糯米，淘洗干净后 浸泡 过夜 ，使米 粒 中的淀粉粒子吸水膨胀，便于蒸煮糊化 ，清水冲洗至 水清亮，捞起 沥干。 隔水蒸煮： 将糯米放在蒸锅内搁架的纱布上隔水蒸煮， 15磅 1020min，常压 30min，至米饭熟透为止。 要求达到熟而不糊，外硬内软，内无夹心，疏松易散，透而不烂，均匀一致。 淋 水 降温 ：用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至 35℃左右，同时使饭粒松散。 接入种曲酿制 ：将冷却到 35℃左右的米饭 ，按干糯米重量换算接种量，将 %的经粉碎的根霉曲与米饭拌匀，盛于 广口培养瓶 中，饭粒搭成中心下陷的 喇叭形 凹窝，以利于出汁，饭面均匀撒上少许曲粉，用 封口膜及 牛皮纸覆盖于 广口培养瓶 表面，用线包扎后置于 30℃温箱保温培养 48h即可 食用。 酿成的甜酒酿应是醪液清澈半透明而甜醇爽口。 品尝 （二）甜酒药中糖化菌的分离 无菌操作技术，以平板划线法分离甜酒药中的糖化菌 1. 每组取无菌培养皿两付，先在培养皿中加入两滴 5000U/mL 的链霉素液，而后用已融化的马铃薯 蔗糖 琼脂培养基倒平板，使链霉素与培养基充分混匀，制成平板。 2. 取已被碾碎的甜酒药粉 1环在平板上划线，然后倒置于 28~30℃ 恒温箱中培养 4~6d。 3. 观察平板上的菌落形态，用接种环调取霉菌菌落的孢子或菌丝体于新鲜的马铃薯 第 7 页 共 14 页 蔗糖 琼 脂平板上，再进行划线培养，直至获得纯培养，即平板上只有一种霉菌的菌落或菌苔。 对已分离出的糖化菌进行个体形态的观察 ，如孢囊梗、孢囊、囊轴、假根、匍匐菌丝。 ，滴一滴乳酚油，然后用解剖针挑取少量带有孢囊的分离菌菌丝放在悬滴液中，将菌丝分散平铺，然后盖上盖玻片，轻轻一压，注意应避免气泡产生。 ：先用低倍镜观察菌丝有无隔膜，孢囊梗的形态，孢囊的着生方式，孢囊和囊轴的形态和大小。 然后换成中倍镜观察，绘制分离菌的形态图，注明各部位名称。 并根据菌落和菌体形态特征，判断出该分离菌是何种真菌。 五、实验报告 实验结果 (1)发酵期间每天观察、记录发酵现象。 (2)对产品进行感官评定， 将各批发酵的甜酒酿品评结果记录于下表中。 写出品尝体会。 批 次 品 评 项 目 结论 出汁（ ml） 口感 酒度 甜味 异味 pH 1 2 3 4 甜酒酿制作中有哪 几 类微生物参与发酵作用。 各自起何种作用。 成功制作甜酒酿的关键步骤是什么。 实验四 柠檬酸产生菌的分离 及 柠 檬酸的 固体 发酵 一、目的 要求 学习从环境中选出能产柠檬酸的霉菌，了解从环境中获得 目的 菌种的一般方法； 掌握柠檬酸的 发酵 、提取、检测 方法。 二、实验原理 柠檬酸发酵是利用微生物在一定条件下的生命代谢活动而获得产品的。 不论采用何种菌株，柠檬酸发酵都是典型的好氧发酵。 工业上的好氧发酵发基本上有三种，即表面发酵、固体发酵和深层发酵。 前两种方法利用空气气相中的氧气，后者则是利用液体中的溶解氧。 至今在柠檬酸发酵工业中，上述三种发酵工艺均并存。 虽然液体深层发酵法已大量代替了固体发酵法，但处于一些废渣的利用及投资较 少的缘故，在一些地方浅层固体法生产柠檬酸仍在使用中。 适合于固体发酵法生产柠檬酸的原料诸如：甘薯渣、木薯渣、苹果渣和甘蔗渣等。 柠檬酸的固体发酵工艺分为浅层法和厚层法，均是将发酵原料、辅料及菌体放在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中的可发酵成分转化为柠檬酸的过程。 黑曲霉发酵糖类生成柠檬酸的能力很强，其主要特征是耐酸性极强，在 pH 为 的情况下，仍能良好生长。 利用这一特点，采用 pH 为 的酸性营养滤纸即可分离该菌种； 发酵产物中 柠檬酸为多盐有机酸，能与 CaCO3 形成沉淀 ，利用钙盐法即可检测。 三、实验材料及用品 样品：霉烂的桔皮 菌种：黑曲霉（ Aspergillus . niger） IFFI 2315 第 8 页 共 14 页 培养基和试剂： （ 1） 酸性蔗糖培养基 蔗糖 15% % % MgSO4•7H2O % 用盐酸调 pH≤ 121℃ 灭菌 20min （ 2） 固体发酵培养基 米糠 :麸皮 =2:1， 65%水分（ 45ml:50g）， 121℃ 灭菌 30min （ 3） NaOH 溶液 ， 1M盐酸 （ 4） %酚酞指示剂 ： ，溶于 100ml 95%乙醇中 器皿： 白瓷托盘，保鲜膜，切刀，菜板，培养皿（带滤纸）， 250ml 三角瓶，摇床， 恒温培养箱， 灭菌锅，酸碱滴定管， 纱布，牛皮纸 四、实验步骤 （一）深层液体发酵 菌种分离： 取霉烂桔皮（ ）放入 10ml 三角瓶中，振荡 3～ 5min，然后用水稀释 5～ 10倍； 菌种纯化： 取稀释液 ～ 1ml 放入酸性培养基上（稀释液：培养基 =1： 10），摇匀，倾倒在平皿中的滤纸上， 25℃ 培养 2～ 3d即有菌落产生 ； 发酵： 将培养出的霉菌接种入 液体 酸性蔗糖发酵培养基 中 （ 25ml/250ml 三角瓶） ， 30℃摇床培养 2～ 3d，过滤收集发酵液。 （二）浅层固体发酵 培养基制备：将米糠：麸皮按照 2： 1的比例配料，加 65%的水分（ 45ml:50g），拌匀后按 15g/250ml 分装到三角瓶中，用纱布牛皮纸封扎瓶口，于 121℃，灭菌 30min。 接种：将培养基趁热打散，待降温到 37℃，即可 将黑曲霉 孢子接种到其中，振荡混匀。 发酵：培养温度 3032℃ ，经 24h培养后摇瓶一次，测 pH；将三角瓶放平后继续培养24h 左右使培养基结成块状。 此时应 扣瓶使之充分通气并散热 ，测 pH； 再培养 72h 使瓶内长满丰盛的孢子即可出料，测 pH。 产物检测： （ 1）柠檬酸鉴定 取 5ml 发酵液 于试管中 ，滴入 饱和 CaCO3溶液，有白色沉淀则 证明产生柠檬酸。 （ 2）产酸量测定 取 10ml 发酵液 （ 10g醅样，加蒸馏水 100ml 浸泡 15min 后过滤得滤液） ， 滴加 %酚酞指示剂 2滴， 用 标准 NaOH 溶液 滴定至淡粉红色，计算。