药品生物检定技术教案

药品生物检定技术教案内容摘要：

试液 2ml，每 1ml 供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固， 培养，计数。 每 1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为 1ml 的菌落数，计算每 1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 ②离心沉淀集菌法 取一定量的供试液， 3000 转／分离心 20 分钟（供试液如有沉淀，先以 500 转／分离心 5 分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，取底部集菌液约 2ml，加稀释液补至原量。 ③薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的 “ 薄膜过滤法 ”。 ④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。 中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。 本 节 小结 ： （ 10 分钟） 1． 微生物限度检查法定义 2．检查项目包括 3．常用的微生物限度检查法 4．检验量 5．供试液的制备 作 业 主要 参考 资 料 1． 《中国药典》 2020 年版二部 2． 《中国药品检验标准操作规范》 2020 年版 3． 《生物药物分析》 2020 年版 白秀峰主编 中国医药科技出版社 课后自我 总结分析 《 药品生物检定技术 》教案 第 7 次课 ２学时 章 节 第四章 药品的微生物限度检查 法 第二节 实践操作 教学目的 和 要求 1．熟悉微生物总数检查的概述。 2．掌握微生物总数检查的注意要点。 3．熟悉药品微生物限度标准。 4．掌握微生物的总数检查。 教 学 重 点 难 点 【 重点 】 １ ．微生物总数检查的注意要点。 ２ ．微生物的总数检查及 SOP。 【 难点 】 微生物的总数检查及 SOP。 教 学 过 程 【教学方法】 讲授法、提问法、练习法 【辅助手段】 多媒体教学 、录像 【教学内容】 三、细菌、霉菌及酵母菌计数 （一）计数方法的验证 （ 15 分钟 ） 验证的目的：确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。 就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。 验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌。 菌株选择的原则：代表性 ,普遍性 ,低或非致病性 ,标准菌株 (或该药品中常见的污染菌 )。 菌种的要求：不得超过 5 代。 采用适宜的方法保存。 菌液制备： 50～ 100cfu/ml。 计数验证用菌种 菌液的制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营 养琼脂培养基中，培养 18~24 小时。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养 24~48 小时。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 5~7 天。 上述培养物用 ％无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数 50~100cfu(菌落形成单位 )的菌悬液。 验证方法 （ 30 分钟） 所有验证方法的操作均应在阳性接种间。 验证方法包括：细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证、控制菌检查方法的验证。 验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收 率。 （ 1）试验组 平皿法计数时：取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml和 50～ 100CFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌数。 薄膜过滤法计数时：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入 50～ 100 CFU 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 （ 2）菌液组 测定所加的试验菌数。 （ 3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 （ 4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心 或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每 lml 供试液含 50～ 100CFU，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 结果判断 （ 10 分钟） 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于 70%。 试验组的菌回收率应均不低于 70%。 照该供试液制备方法和计数法测定供试品细菌、霉菌及酵母菌数。 若任一次试验组的菌回收率低于 70%，应采取培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等 方法 或联合使用这些方法消除抑菌成分，并重新验证。 （二）供试品检查法 计数方法包括平皿法和薄膜过滤法 检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。 1．平皿法 （ 5 分钟） 常规法和培养基稀释法都是平皿法。 供试液通过离心沉淀以后也可用平皿法检查。 采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续 2～ 3 个稀释级的供试液。 阴性对照试验 取试验用的稀释液 1ml 置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。 每种计数用的培养基各制备 2 个平板（共 4 个平板），均不得有菌生长。 培养与计数 在特殊情 况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。 以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。 含蜂蜜、王浆的液体制剂：用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。 平皿法菌数报告规则 2．薄膜过滤法 （ 20 分钟） 滤膜孔径应不大于 m，直径一般为 50mm。 选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。 滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。 使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 阴性对照 试验：取试验用的稀释液 1ml 照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。 阴性对照不得有菌生长。 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过 100 个。 薄膜过滤法菌数报告规则 （三）结果判断 （ 10 分钟） 供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以 3 次结果的平均值报告菌数。 眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。 （四）报告书写 （ 5 分钟） 本 节 小结 ： （ 5 分钟） 1．供试品检查法 2．结果判断 作 业 主要 参考 资 料 1． 《中国药典》 2020 年版二部 2． 《中国药品检验标准操作规范》 2020 年版 3． 《生物药物分析》 2020 年版 白秀峰主编 中国医药科技出版社 课后自我 总结分析 《 药品生物检定技术 》教案 第 8 次课 ２学时 章 节 第五章 控制菌及螨类检查 第一节 必备知识 第二节 实践操作 教学目的 和 要求。 控制菌检查的意义。 教 学 重 点 难 点 【 重点 】 １ ． 大肠埃希菌的检查及 过程。 【 难点 】 1．控制菌检查的方法 教 学 过 程 【教学方法】 讲授法、提问法、练习法 【辅助手段】 多媒体教学、录像 【教学内容】 一、控制菌检查 药典收载的控制菌：大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌。 （一）控制菌检查方法的验证 （ 20 分钟） 控制菌试验菌株： 菌液制备 用 %无菌氯化钠溶液制每 1ml 含菌数为 10～ 100cfu 的菌悬液。 验证方法 (1）试验组 （ 2）阴性菌对照 组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。 方法同试验组。 （ 3）验证结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。 若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。 若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 （二）供试品检查法 （ 60 分钟） 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。 阳性对照试验 阴性对照试验 控制菌 检查 基本程序： 供试液制备→增菌培养→选择性培养基（分离）培养→挑取疑似菌落（纯培养）→生化试验→报告结果 控制菌检查： ⑴大肠埃希菌 ①检验程序 ②供试液制备 ③ BL 增菌培养 取供试液 10ml(相当于供试品 1g， 1ml， 10cm2)，直接或处理后接种至适量的(不少于 100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养 1824 小时，必要时可延长至 48小时。 ④检查大肠埃希菌 取上述培养物 ，接种至含 5ml MUG 培养基的试管内，培养，于 5 小时、24 小时在 366nm 紫外线下观察，同时用未接种的 MUG 培养基作本底 对照。 若管内培养物呈现荧光，为 MUG 阳性；不呈现荧光，为 MUG 阴性。 观察后沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性。 呈试剂本色，为靛基质阴性。 本底对照应为 MUG 阴性和靛基质阴性。 ⑤大肠埃希菌结果判断 ⑥结果报告 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验 MUG 呈阳性。 供试品 MUG 阳性、靛基质阳性，报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠埃希菌。 MUG 阴性、靛基质阴性，报告 1g 或 1ml 供试品未检出大肠埃希菌。 MUG 阳性、靛基质阴性。 IMViC 试验为一十一一、革兰阴性杆菌，报告 1g或 lml 供试品检 出大肠埃希菌； MUG 阴性、靛基质阳性、 IMViC 试验为十十一一、革兰阴性杆菌，报告1g 或 1ml 供试品检出大肠埃希菌。 不符合③④报告 1g 或 1ml 供试品未检出大肠埃希菌。 ⑵大肠菌群的检查 只对中成药制剂：含原药材粉未、豆豉、神曲的中药口服制剂必需检。 大肠菌群的检查程序：供试品→供试液→胆盐乳糖发酵培养基→产酸产气→EMB 或 MACL（分离）培养→乳糖发酵培养基→ 产酸产气→报告结果。 本 节 小结 ： （ 10 分钟） 大肠埃希菌：①检验程序②结果报告 作 业 主要 参考 资 料 1． 《中国药典》 2020 年版二部 2． 《中国药品检验标准操作规范》 2020 年版 3． 《生物药物分析》 2020 年版 白秀峰主编 中国医药科技出版社 课后自我 总结分析 《药品生物检定技术》教案 第 9 次课 ２学时 章 节 第五章 控制菌及螨类检查 第一节 必备知识 第二节 实践操作 教学目的 和 要求 沙门菌和 、铜绿假单胞菌 的检查。 控制菌检查的意义。 教 学 重 点 难 点 【 重点 】 １ ．大肠埃希菌的检查及 过程。 【 难点 】 1．控制菌检查的方法 教 学 过 程 【教学方法】 讲授法、提问法、练习法 【辅助手段】 多媒体教学、录像 【教学内容】 一、控制菌检查 药典收载的控制菌：沙门菌、铜绿假单胞菌。 （一）控制菌检查方法的验证（ 20 分钟） 控制菌试验菌株： 菌液制备 用 %无菌氯化钠溶液制每 1ml 含菌数为 10～ 100cfu 的菌悬液。 验证方法 (1）试验组 （ 2）阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。 方法同试验组。 （ 3）验证结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。 若试验组检出试验菌，按此供 试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。 若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 （二）供试品检查法（ 60 分钟） 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。