食品微生物检验技术实验指导

食品微生物检验技术实验指导内容摘要：

杆菌。 一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大 肠菌群数系以每 100g（或 ml）检样内大肠菌群最近似数（ the most probable number简称 MPN）表示。 三、实验仪器与材料 显微镜、恒温箱、水浴锅、天平、可调式电炉、试管、吸管、三角平等；乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管、革兰氏染色液、生理盐水、 鲜肉等 四、方法与步骤 程序：样品处理及初发酵接种 → EMB 平板分离 → 乳糖发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验 → 观察乳糖发酵结果 （一）样品处理及初发酵接种： 样品处理与稀释 （无菌操作） 样品：鲜肉 （ 1） 先将鲜 肉进行表面消毒处理，即沸水内烫 35 秒或烧灼消毒。 再用无菌剪刀剪取深层肌肉 25 克，放于含有 225ml 灭菌生理盐水的玻璃瓶内（内置玻璃珠），经摇床以 800010000r/min 的转速处理 1min 做成 1:10 的均匀稀释液。 （ 2） 取一支 1ml 灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1ml，注入含有 9ml 灭菌生理盐水的试管内，振摇试管使其充分混合均匀，做成 1:100 的稀释液 （ 3）按上法进行操作依次做成 10 倍递增稀释液。 乳糖初发酵试验 （无菌操作） 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度， 每个稀释度接种三管。 （ 1）用 1ml 移液管吸取 稀释液 1ml 分别注入 单料乳糖胆盐发酵管 中，每个稀释度接种 3 支， 共接种 9 支。 （ 2） 放入培养箱培养 ： 将接种后的乳糖胆盐发酵管置 36177。 1℃温箱内，培养 24177。 2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如 有产酸产气者（培养液由紫蓝色变成黄色并有气泡）， 则按下列程序进行试验。 （二） EMB 平板分离 将 产气 的发酵管分别转种在 EMB 琼脂平板上（一管对一个平板），置 36177。 1℃温箱内，培养 18～ 24h，然后取出， 观察菌落形 态 ，并挑取可疑菌落做：革兰氏染色和证实试验。 在 EMB 平板上的典型菌落： 呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。 由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。 （三） 乳糖复发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验 乳糖发酵接种 从 EMB 平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1～ 2 个同时接种乳糖发酵管，置 36177。 1℃温箱内培养 24177。 2h，观察产气情况。 进行镜检 从 EMB 平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1～ 2 个进行革兰氏染色。 大肠菌群菌：革兰氏染色阴性无芽胞短杆菌。 进行靛基质试验 向培养后的蛋白胨水中 沿管壁 加入靛基质试剂 （欧 — 波试剂） ，静置片刻，观察液面。 阳性 反应者，液面 呈玫瑰红色 ；阴性反应液面呈试剂本色。 则证实为粪大肠菌群阳性。 （四）观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗 观察乳糖发酵结果 观察： 乳糖发酵管内是否有气体产生 凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 查表报告结果 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN 检索表，报告每 100mL(g)大肠菌群的 MPN 值。 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查 MPN 检索表，报告每 100mL(g)粪大肠菌群的 MPN 值。 五、思考题 大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管。 为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实。 复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需要加胆盐。 所有发酵管均为阴性反应时，检验结果可否报告为“零”。 实验四 鲜蛋蛋液中志贺氏菌及其检验 一、目的要求 了解志贺氏菌生物学特性及原理 掌握志贺氏菌检验方法 二、实验原理 志贺氏菌属（ Shigella）的细菌是细菌性痢疾的病原菌，通称痢疾杆菌。 临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。 人类对痢疾杆菌有很高的易感性。 在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为 革兰氏阴性杆菌 ， 长约 23μ m ,宽 m。 不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛 ，不运动，有菌毛。 志贺氏菌属的主要鉴别特征为： 无鞭毛， 不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。 志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。 三、实验仪器与材料 恒温箱、水浴锅、天平、可调式电炉、试管、吸管、三角瓶 GN 增菌液、 EMB 培养基 、 SS 琼脂 、三糖铁斜面、葡萄糖半固体培养蛋白胨水、 5%乳糖发酵管、甘露醇发酵管、棉子糖发酵管、甘油发酵管、兔血浆、多价血清和 26 种因子血清 四、操作步骤 样品处理 无菌操作称取检样 25g，加入装有 225mLGN 增。