降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究_大学本科毕业论文(编辑修改稿)

降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究_大学本科毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

解后， mL。 仪器名称型号生产厂商冰箱BCD215KALM青岛海尔股份有限公司电热恒温培养箱DH6000BH天津市泰斯特仪器有限公司电子天平ALB224赛多利斯科学仪器有限公司单人单面净化工作台SW—CJ—1FD苏州净化设备有限公司恒温振荡器ZD—85A常州澳华仪器有限公司型电热鼓风干燥箱101—2AB天津市泰斯特仪器有限公司型电热恒温鼓风干燥箱DHG—9240上海一恒科技有限公司紫外可见分光光度计721GG上海仪电分析仪器有限公司高速台式离心机TGL—16B上海安亭科学仪器厂、纯化将从贵州茅台酒厂取样到的样品捣碎后， mL无菌水中制备成1%的菌悬液，震荡培养30 min用无菌蒸馏水稀释101010105四个梯度，然后再用无菌吸管吸取100 μL菌悬液滴入牛肉膏蛋白胨培养基上涂布均匀，分别在30 176。 C及50176。 C恒温培养箱中倒置培养2 d，不同处理均作3个重复。 观察培养皿上菌落形成情况，选取优势菌株和透明圈明显的菌株，CMCNa培养基上用两区划线培养进行分离和纯化。 观察牛肉膏蛋白胨各培养基中的菌落形态特征，拍照并作好详细记录。 将纯化的菌株接种到纤维素钠(CMCNa)为唯一碳源的固体培养基的上，每个培养基点2 个样，不同处理均作3个重复。 分别于30176。 C、50176。 C下倒置培养2 d，每天检测观察各菌株的菌落状况，最后通过滴加革兰氏碘液，静置10 min，倾去染液，将平板置于白色背景下，观察透明圈产生的清晰度，测量菌落及浅色透明圈半径（R，mm），并拍照记录。 根据透明水解圈半径和菌落半径的比值大小初步判断菌株产纤维素酶的能力，选取比值大的菌株继续进行研究。 最后保存菌落半径与透明圈比值大于2：4的菌株于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，其活性与透明圈半径/菌落半径（R/r）在冰箱中4176。 C条件下保存，以作下一步的研究[15]。 从斜面保存培养基挑取菌株单菌落， mL LB 液体培养基的试管中，振荡培养12 h，然后取100 μL 菌悬液置入另外盛有10 mL LB 液体培养液的试管中振荡培养。 每4 h取样一次通过分光光度法测定菌体浓度。 以未接种的LB培养液做空白对照，依次测定。 用721G可见分光光度计，在660 nm波长处测定吸光度。 然后以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制菌体生长曲线。 1．葡萄糖标准曲线的绘制取7支10 mL试管，编号，（500 mg/L）溶液与蒸馏水混匀，既得各种不同浓度的标准葡萄糖液。 另取试管7支，编号， mL，对好加入各试管， mL，摇匀，置于沸水中煮沸5 min。 取出后置于冷水浴中冷却，在721G型分光光度计上比色。 选用520 nm波长。 标准葡萄糖液的制备管号制备标准葡萄糖液的浓度（μg/mL）加500ug/ml标准葡萄液（mL）加蒸馏水量（mL）00010140280312041605200466240加入葡萄糖标准液和蒸馏水， mL DNS试剂，于沸水浴中加热5 min进行显色，取出后用流动水迅速冷却， mL，摇匀，用721G可见分光光度计，在520 nm波长处测定吸光度。 mL蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。 以葡萄糖质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 根据DNS (3，5二硝基水杨酸)比色法测定原理绘制葡萄糖标准曲线[16]。 2．粗酶液制备将初筛选取的菌株环取一环接种到纤维素羧甲基钠活化培养液中，30176。 C通过静置培养、50176。 C则在120 r /min下振荡培养24 h，不同处理做3个重复。 每24 h 取一次菌液，3500 r/min 下离心5 min，收集上清液用于测定酶活。 CMC酶活力的测定：取CMC mL于比色皿中， mL 稀释10 倍的酶液，50176。 C 恒温水浴中反应30 min， mL DNS 试剂，沸水浴10 min， mL。 在520 nm 处测OD 值，测得OD 值后查阅葡萄糖标准曲线，求出酶解所得葡萄糖含量，换算成酶活力值。 3．滤纸崩解的测定分别用接种环取一环初筛得到的菌种，将其接种到装有10 mL滤纸培养液的10mL试管中，置于30176。 C、50176。 C恒温摇床，120 r /min下振荡培养，每天检查记录各菌株对滤纸的作用情况[17]。 观察其酶活力的分解强度，以+、—标示作用情况，本方法是以肉眼观察为主，主观意识为主，结果的表示只能为试验提供参考，不能作评判的依据，但用于筛选目标菌株有很大的适用性，再配以其他方法，不是为有效的手段。 具体表示：+滤纸边缘膨胀；+ + 滤纸整齐膨胀并下弯； + + + 滤纸不定形；+ + + + 全成糊状。 若滤纸不到2 4 h 全部分解，则记下达到全部被分解的时间，拍照记录。 4．CMC酶活力测定酶液的稀释：取大号试管13只，用移液管吸取离心后的酶1 mL，加水24 mL，摇匀。 还原糖的测定：取刻度试管26只， mL，CMC缓冲液（柠檬酸缓冲液） mL。 每次测酶活时均设一个总的空白样，即在试管中不加底物和酶液， mL，用作测量吸光度时的参比。 对每个样品都设一个参照样， mL蒸馏水， mL相应样品的粗酶液。 在容积为10 mL的试管管中，加入1 mL 适当稀释的酶液于50176。 C和30176。 C 恒温水浴中预热5 min后，摇匀，将试管置于水浴锅中，50176。 C恒温水浴加热，充分反应30 min。 将试管从水浴锅取出后， mL DNS试剂，然后又放入水浴锅，沸水浴5 min。 迅速冷却试管， mL。 在560 nm 波长处测吸光度并做好记录。 定义每分钟催化纤维素水解生成1 μg葡萄糖的酶量为一个酶活单位，即在50176。 C下，每1 g纤维素酶曲在1 min内水解CMC，生成1 ug葡萄糖的酶活性称作纤维素酶活力单位，记作U。 葡萄糖量=[(mg/mL)•30 min]1/10式中 葡萄糖量：从标准曲线上查的（mg）；1/10： 稀释倍数；30： 糖化时间（min）。 3结果与分析、纯化结果利用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，分101010105四个不同稀释梯度，2至3组平行，从茅台酒丢糟、301车间丢糟、酒曲、酒醅、茅台有机高粱基地土壤、废旧稻草样品中初步分离到近千个菌株，在观察菌落生长状况、菌落形态特征的同时。 细菌的纯化一般采用二区划线法，通过这种方式，进一步分离所筛选的菌种。 菌落计数统计菌株编号稀释102（计数） 稀释103（计数） 稀释 104（计数） 稀释105（计数）茅台酒糟B1200328244248301车间酒糟B2400以上1051423454713茅台大曲B3700以上741083238414茅台酒醅B41241651722411茅台有机高粱基地土壤B5500以上2012743456817废旧稻草B6连片连片2893213257根据菌落数30300为最佳，B1的最佳稀释度为10103，B2的最佳稀释度为10104，B3的最佳稀释度为10104，B4的最佳稀释度为10103，B5的最佳稀释度为10104，B6的最佳稀释度为105。 通过对近千个菌株的初筛，用羧甲基纤维素钠鉴定培养基进行培养，滴加革兰氏碘液有透明圈的244株。 其中， cm，BL595透明圈与菌落半径比值最大的，达到15。 透明圈与菌落半径比值超过10的有12株，透明圈与菌落半径比值超过5的有103株。 50176。 C培养条件下的，选取透明圈半径超过2 cm，透明圈与菌落半径比值大于3的7株菌；30176。 C培养条件下的， cm，透明圈与菌落半径比值大于5的6株菌。 共选取13株菌进行纤维素酶活力等测定。 几株细菌CMC培养基透明圈情况将透明圈与菌落半径比值较突出的13株菌，根据初筛过程顺序分别。