基因工程操作技术

基因工程操作技术内容摘要：

p 的 DNA 片段就能分开。 聚丙烯酰胺凝胶电泳很快 ,可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。 聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。 目前 ,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行 DNA 电泳。 琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质 ,其密度取决于琼脂糖的浓度。 在电场中 ,在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移 ,其迁移速率由下列多种因素决定 : DNA 的分子大小 : 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA 分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状 DNA 分子 ,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。 DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 凝胶浓度的选择取决于 DNA 分子的大小。 分离小于 的DNA 片段所需胶浓度是 %,分离大于 10kb 的 DNA 分子所需胶浓度为 %, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为 %。 DNA 分子的构象 当 DNA 分子处于不同构象时 ,它在电场中移动距离不仅和分子量有关 ,还和它本身构象有关。 相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的 ,超螺旋 DNA 移动最快 ,而线状双链 DNA 移动最慢。 如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条 DNA 带难以确定是质粒DNA 不同构象引起还是因为含有其他 DNA 引起时 ,可从琼脂糖凝胶上将 DNA 带逐个回收 ,用同一种限制性内切酶分别水解 ,然后电泳 ,如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱 ,则为同一种 DNA。 电源电 压 在低电压时 ,线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。 但是随着电场强度的增加，不同分子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长 ,片段越大 ,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大 ,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。 要使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最大 ,所加电压不得超过 5v/cm。 嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状 DNA，使其刚性更强 ,还会使线状 DNA 迁移率降低 15％。 离子强 度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。 在没有离子存在时 (如误用蒸馏水配制凝胶 ),电导率最小 ,DNA 几乎不移动 ,在高离子强度的缓冲液中 (如误加 10电泳缓冲液 ),则电导很高并明显产热 ,严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性。 对于天然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有 TAE[含 EDTA ()和 Tris乙酸 ],TBE(Tris硼酸和 EDTA),TPE(Tris磷酸和 EDTA),一般配制成浓缩母液 ,储于室温。 第二节 材料、设备及试剂 一、 材料 9 λDNA: 购买或自行提取纯化。 重组 pBS 质料或 pUC19 质粒。 EcoRI 酶及其酶切缓冲液 : 购买成品。 HindⅢ 酶及其酶切缓冲液 : 购买成品。 琼脂糖 (Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 二、 设备 水平式电泳装置 ,电泳仪 ,台式高速离心机 , 恒温水浴锅 , 微量移液枪 , 微波炉或电炉 ,紫外透射仪 , 照相支架 , 照相机及其附件。 三、 试剂 5TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。 6电泳载样缓冲液： ％ 溴粉蓝， 40％ (w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 溴化乙锭 (EB)溶液母液 :将 EB 配制成 10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器 ,储于 室温即可。 第三节 操作步骤 一、 DNA 酶切反应 将清洁干燥并经灭菌的 eppendorf 管 (最好 )编号 ,用微量移液枪分别加入 DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应 10缓冲液 2μl,再加入重蒸水使总体积为 19μl,将管内溶液混匀后加入 1μl酶液 ,用手指轻弹管壁使溶液混匀 ,也可用微量离心机甩一下 ,使溶液集中在管底。 此步操作是整个实验成败的关键 ,要防止错加，漏加。 使用限制性内切酶时 应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 混匀反应体系后 ,将 eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上） ,37℃ 水浴保温 23 小时 ,使酶切反应完全。 每管加入 2μl (),混匀 ,以停止反应 ,置于冰箱中保存备用。 二、 DNA 分子量标准的制备 采用 EcoRⅠ 或 HindⅢ 酶解所得的 λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。 λDNA为长度约 50kb的双链 DNA 分子 ,其商品溶液浓度为 ,酶解反应操作如上述。 HindIII 切割 DNA 后得到 8个片段 ,长度分别为 , , , , , , 和。 EcoRI 切割 lDNA 后得到 6 个片段 ,长度 分别为 , , , , 和。 三、 琼脂糖凝胶的制备 取 5TBE 缓冲液 20ml 加水至 200ml,配制成 TBE 稀释缓冲液 ,待用。 胶液的制备：称取 琼脂糖 ,置于 200ml 锥形瓶中 ,加入 50ml TBE 稀释缓冲液 ,放入微波炉里 (或电炉上 )加热至琼脂糖全 部熔化 ,取出摇匀 ,此为 ％琼脂糖凝胶液。 加热过程中要不时摇动 ,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。 加热时应盖上封口膜 ,以减少水份蒸发。 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏 (宽约 1cm)紧密封住。 将封好的胶槽置于水平支持物上 ,插上样品梳子 ,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙。 向冷却至 5060℃ 的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭 (EB)溶液使其终浓度为 /ml(也可不把 EB加入凝胶中 ,而是电泳后再用 )。 用移液器吸取少量融化的 琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧 ,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内 ,使胶液形成均匀的胶层。 倒胶时的温度不可太低 ,否则凝固不均匀 ,速度也不可太快 ,否则容易出现气泡。 待胶完全凝固后拨出梳子 ,注意不要损伤梳底部的凝胶 ,然后向槽内加入 TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 因边缘效应样品槽附近会有一些隆起 ,阻碍缓冲液进入样品槽中 ,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 加样：取 10μl酶解液与 2μl 6载样液混匀 ,用微量移液枪小心加入样品槽中。 若 DNA 含量 10 偏低 ,则可依上述比例增加上样量 ,但总体积不可超过样品槽容量。 每加完一个样品要更换 tip 头 ,以防止互相污染 ,注意上样时要小心操作 ,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 电泳：加完样后 ,合上电泳槽盖 ,立即接通电源。 控制电压保持在 6080V,电流在 40mA 以上。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时 ,停止电泳。 染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入 ,室温下染色 2025 分钟。 观察和拍照：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有 EB 的电泳胶板。 DNA 存在处显示出肉眼 可辨的桔红色荧光条带。 紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩 ,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈 ,曝光时间 10120 秒 (根据荧光条带的深浅选择 )。 DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上 ,以样品槽为起点 ,用卡尺测量 λDNA 的EcoRⅠ 和 HindⅢ 酶切片段的迁移距离 ,以厘米为单位。 以核苷酸数的常用对数为纵坐标 ,以迁移距离为横坐标 ,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线 ,即为该电泳条件下 DNA 分子量的标准曲线。 DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上 ,用卡尺量出 DNA 样品各片段的迁移距离 ,根据此数值 ,在 DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值 ,进一步计算出各片段的分子量大小 (若用单对数坐标纸来绘制标准曲线 ,则可根据迁移距离直接查出 DNA 片段的大小 )。 反之 ,若已知 DNA 片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 DNA 酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切 ,双酶切和多酶切的电泳分析结果 ,对照 DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理 ,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。 以环状图或直线图表示 ,即成该 DNA 分子的限制性内切酶图谱。 [注意 ] DNA 溶液体积不能太大，否则 DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。 酶活力通常用酶单位（ U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下， 1 小时完全降解 1mg lDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的 DNA 不象 lDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使用量。 反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（ 1）进行稀释。 另外， 酶通常保存在 50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10 之下，否则，酶活性将受影响。 观察 DNA 离不开紫外透射仪 ,可是紫外光对 DNA 分子有切割作用。 从胶上回收 DNA 时 ,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯 (300360nm） ,以减少紫外光切割 DNA。 EB 是强诱变剂并有中等毒性 ,配制和使用时都应戴手套 ,并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。 凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 当 EB 太多 ,胶染色过深 ,DNA 带看不清时 ,可将胶放入蒸馏水冲泡 ,30 分钟后再观察。 思考题 1. 如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被切动 , 你认为可能是什么原因。 2. 琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响。 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节 概 述 在自然条件下 ,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内 ,但在人工构建的质粒载体中 , 11 一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因 ,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。 转 化 (Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞 ,使之获得新的遗传性状的一种手段 ,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些特殊方法 (如电击法 ,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法 )的处理后 ,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变 ,成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞 (Compenent cells)。 进入受体细胞的 DNA 分子通过复制 ,表达实现遗传信息的转移 ,使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子 (Transformant,即带有异源 DNA 分子的受体细胞 )。 目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl)法， RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高 ,但 CaCl2 法简便易行 ,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求 ,制备出的感受态细胞暂时不用时 ,可加入占总体积15％的无菌甘油于 70℃ 保存 (半年 ),因此 CaCl2 法为使用更广泛。 为了提高转化效率 , 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度 : 不要用经过多次转接或储于４ ℃ 的培养菌，最好从－ 70℃ 或 20℃ 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。 DH5α菌株的 OD600 为 时 ,细胞密度在 5107 个 /ml 左右(不同的菌株情况有所不同 ),这时比较合适。 密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度 : 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。 转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比 ,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时 ,转化效率就会降低。 1ng 的 cccDNA 即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。 一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5％。 3. 试剂的质量 : 所用的试剂 ,如 CaCl2 等均需是最高纯度的 ( AR.),并用超纯水配制 ,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行 , 所用器皿 , 如离心管 , tip头等最好是新的 ,并经高压灭菌处理 ,所有的试剂都要 灭菌 ,且注意防止被其它试剂、 DNA。