生物技术概论思考题

生物技术概论思考题内容摘要：

于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。 4 简述动物细胞培养的一般步骤。 大量培养哺乳动物细胞的方法有哪些。 培养动物细胞的一般步骤 : 取出目的细胞所在组织→ 洗净 → 切成小组织块 → 解离液中离散细胞 → 洗涤细胞 → 目的细胞移入培养瓶培养。 大量培养哺乳动物细胞的三种方法 : ①微导管培养法 由硝酸纤维素或醋酸纤维素制外径小于 l mm 的多层微导管床浸没于培养基中。 管内的无菌空气经扩散可进入营养液中，动物细胞贴附生长于微导管表面，细胞密度达 100 万个 /cm2。 ②微载体培养法 以葡萄糖聚合物或其他聚合物制成与培养基比重基本相等的直径从几十微米到几百微米的固体小珠 —— 微载体。 ③微胶囊培养法 将动物细胞与大约 4%的褐藻酸钠混合后，滴到 CaCl2 溶液中，制成半透性微胶囊。 5 细胞融合常用的方法有哪些。 各有什么优 缺点。 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段： ①两种细胞在一起培养，加入病毒，在 4℃条件下病毒附着在细胞膜上。 并使两细胞相互凝聚； ②在 37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要 Ca2+和 Mg2+，最适 PH 为 一 ； ②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需 Ca2+和 ATP； ④融合成巨大细胞，仍需 ATP。 （ PEG）法 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。 电融合法的优点： 1)融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 2）装置精巧、方法 简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 3）免去 PEG 诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。 6 简述胚胎移植的程序。 供体和受体的选择 超数排卵处理 供体母畜的配种 胚胎的收集 胚胎的检查 胚胎的保存与培养 供体和受体的术后观察 7 简述核移植操作的一般程序。 核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（ 寄母）等步骤。 1．核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。 这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的 MⅡ卵母细胞。 二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘 — 卵母细胞复合体 (COCs)，在体外培养成熟后作为受体。 2．核供体细胞的准备 在核移植操作中，细胞核供体细胞首 先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。 供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。 另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。 3． 细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。 即 通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从 MII 期中解放出来，并转到‚受精‛的状态。 5．重组胚的体内或体外培养 经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。 6．胚胎移植 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。 8 核移植技术的应用哪些领域。 核移植技术意义和存在的问题。 应用： 1） 制备转基因克隆动物， 进行生物药物生产； 2） ．培育优良畜种，扩大良种种群 ； 3） 开展异种动物克隆，拯救濒危动物； 4） 与干细胞技术结合，开展治疗性克隆 5） 利用核移植技术，研究生物学的基本问题。 重要生物学意义：第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。 第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。 它的成功提示我们可以进一步做到，在培育体细胞成为核供体之前，利用‚基因靶‛技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。 也就是 说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。 第三，在现代生物学领域中， 没 有任何一项研究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问题的先例。 多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。 克隆技术存在的问题 理论问题 ： a 分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚； b 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。 c 克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。 d 在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 实践问题 ： a 克隆动物的成功率还很低 b 生出的部分个体表现出生理或免疫缺限 ， 早衰迹象 9 利用已学的干细胞知识，论述干细胞在人类健康中的作用 （一）治疗方面 ： 作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞 ； 作为疾病基因治疗的载体 （二）研究方面 ： 探讨胚胎发育的调控机制 ； 利用胚胎干细胞体外整合外源基因，研究基因功能及与疾病的关系 ； 药物筛选平台的建立，药理研究与新药开发 干细胞治疗研究及临床应用 ： 1）临床前研究和临床试验： 神经干细胞 : 中风 , MS, ALS, 脑瘫 ,痴呆，记忆力丧失，脑外伤，脊髓损伤，失明 间充质干细胞 : 肾脏、肝脏、胰腺和脑损伤，肠道疾病，骨关节病 肝 /胰腺干细胞 : I 型和 II 型糖尿病，肝炎和肝病，肝癌 造血干细胞：贫血，骨髓疾病，免疫系统疾病，慢性感染，狼疮，类风湿关节炎 皮肤干细胞：烧伤，皮肤移植，皮肤疾病 肌肉干细胞：肌营养不良症，心肌病，心脏病发作造成的损伤 肺细胞干细胞：肺气肿，肺部疾病 2） 临床应用： 造血干细胞移植（白血病、淋巴瘤） 结合胚胎干细胞、成体干细胞、胰腺干细胞、骨髓间充质干细胞、骨髓造血干细胞、脐血干细胞、肝脏干细胞、干细胞与糖尿病治疗、干细胞与心脏病治疗、干 细胞与神经系统疾病、干细胞治疗帕金森病、干细胞与脊髓损伤、干细胞与基因治疗、肿瘤干细、急性髓性白血病（ AML)、脑肿瘤 、乳腺癌 、结肠癌 、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、脑肿瘤回答（自由发挥） 10 肿瘤干细胞的起源有哪些。 研究肿瘤干细胞有哪些意义。 肿瘤干细胞（ CSCs)是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤的细胞。 肿瘤干细胞的起源 — 基因突变 、细胞融合。 肿瘤干细胞的意义：针对预防和治疗肿瘤干细胞的临床干预措施 a 降低风险：多酚，如异黄酮；b 早期检测：检测增值的干细胞及分泌的分子标记物，如 EZH2； c 预防： 促进干细胞的凋亡雨分化，如维生素 D； d 治疗：常规疗法； e 靶向肿瘤干细胞的治疗，如γ分泌酶抑制剂 11 什么是 iPS 细胞。 简述 iPS 细胞的应用前景。 即 诱导性多潜能干细胞 ， 是将体细胞经过基因改造转化为具有多向分化潜能和自我更新能力的人造干细胞。 iPS 细胞的应用前景 ： 核移殖技术、诱导性多潜能干细胞、肿瘤干细胞、干细胞与基因治疗（参考）。 利用iPS 细胞在疾病模型中进行细胞替代治疗：镰刀形细胞贫血症、血友病 A、帕金森病、急性心肌梗死、糖尿病利用 iPS 细胞还原疾病的病理过程、提供体外疾病模型、以及建立特异性 iPS 细 胞系。 日本首次成功把人皮肤成纤维细胞改造成类似胚胎干细胞的多潜能干细胞。 第四章 蛋白质与蛋白质组学思考题 1 蛋白质分离与纯化包括哪几个步骤。 材料的选择与预处理 确定有效成分含量测定方法 细胞的破碎 （机械破碎；溶胀和自溶；化学处理、生物酶降解） 提取 纯化（包括盐析、有机溶剂沉淀、有机溶剂萃取、吸附、层析、超速离心及结晶等） 浓缩、干燥及保存 2 确定样品中蛋白质有效成分的方法有哪些。 分光光度计、荧光分析法、生物活性测定、电泳分析、化学分析法、免疫分析法 3 影 响蛋白质抽提效果的因素有哪些。 1） PH 值 2） 溶剂的极性和离子强度 3） 水解酶（加入抑制剂、调节抽提液 PH、离子浓度或极性） 4）温度（ HCG、尿苷丙酮酸羧化酶） 5） 搅拌 6） 金属离子（重蒸水、 EDTA、 5:1） 7） 氧化（ 2巯基乙醇、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、巯基乙酸盐） 4 蛋白质的等电点。 当蛋白质溶液处于某一 pH 时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。 5 蛋白质沉淀包括哪两大类。 这两大类各有什么特点。 （ 1） 可逆沉淀：温和条件，改变溶液 pH 或 Pr 所带电荷 ； Pr 结构和性质没有变化 ； 适当条件下可重新溶解 ； —— 非变性沉淀 ； pI 沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 (2)不可逆沉淀：强烈沉淀条件。 破坏 Pr 胶体溶液稳定性。 也破坏 Pr 结构和性质。 沉淀不能再重新溶解。 —— 变性沉淀；加热沉淀、强酸 /碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等 6 盐析沉淀法的原理是什么。 盐析原理 :蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为 蛋白质的盐析。 这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。 但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。 7 什么是双水相萃取法。 常用的双水相系统有哪些。 双水相萃取与水 有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。 当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等） 的 存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。 其分配情况服从分配定律，即，‚在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数‛， 常用的双水相系统有 :聚 乙 二醇 (PEG) + 磷酸钾 (Kpi) 聚 乙二 醇 (PEG) + 葡聚糖 (DX ) 8 蛋白质纯化中层析的原理是什么。 层析方法包括哪些种类。 层析原理：利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的形状和大小、分子的极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在 两相中，其中一个相是固定的，称为固相，另一个相是流动的，称为液相。 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。 层析方法包括 吸附层析、分配层析、凝胶层析、亲和层析、薄层层析、离子交换层析 9 亲和层析的原理是什么。 简单介绍其应用 1）原理： 亲和层析是利用抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。 所以将抗原 （或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 亲和层析技术具有高效、快速、简便等优点。 2）应用： 已广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等，也用于分离细胞、细胞器、病毒等。 还应用于不稳定蛋白质的贮藏；从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子；分离核酸等。 亲和层析因其独有的优势在生物、医药和食品等领域具有非常广阔的应 用前景。 实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶 ,但是从实际操作和经济角度考虑，该法不适合大规模处理。 10 蛋白质工程的定义。 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。 包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因 ,合成新蛋白质等。 11 蛋白质工程主要内容和基本目的是什么。 蛋白质结构分析 —— 基础 ；结构、功能的设计和预测 —— 基础的应用与验证；创造和 /或改造蛋白质（新蛋白质） —— 终目标 基础研究包括蛋白质合成机理、蛋白质折叠机理 、蛋白质序列语言的语法研究、生命起源与蛋白质分子进化、生物的寿命与蛋白质代谢的研究。 研究的核心内容机构功能的设计和预测、蛋白质结构分析、创造和改造 . 蛋白质工程的目的改变蛋白质的生物活性；改变蛋白质的稳定性；改变蛋白质的特性；用于蛋白质与功能研究 13 蛋白质分子结构包括哪几级结构。 试述各种结构。