猪瘟与高致病性蓝耳病混合感染的诊治——毕业论文(编辑修改稿)

猪瘟与高致病性蓝耳病混合感染的诊治——毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

（ 8）结果判定： 首先对阴阳性对照进行判定： 阴性对照 呈无色或浅黄色，阳性对照呈明显黄色，表示试验有效。 结果所有板子阴性对照呈无色，阳性对照均为明显黄色，说明所有检测猪瘟抗体 ELISA试剂盒有效。 有效 待检孔 OD值大于阴性对照 OD值平均值的。 如阴性对照 A值的平均值低于。 猪蓝耳病抗体及猪伪狂犬病抗体 ELISA 检测方法 （ 1）洗涤液配制：取出各试剂盒浓缩的洗涤液恢复至室温，之后于 37℃ 水中加热 10min，摇动使沉淀的盐溶解，然后用去离子水作 20倍稀释。 各试剂盒中的试剂均单独稀释并作好标记，用于对应的试剂和盒上，不 混用。 （ 2）样品稀释：待检血清用样品稀释液 1： 40稀释，阳性和阴性对照用样品稀释液 1： 4稀释。 （ 3）加样反应：取 PRRSV及 PRV检测板，用各自稀释好的洗涤液洗板 2次（ 200181。 L孔）每次静置 2min后倒掉，再在干净吸水纸上拍干。 取稀释好的待检样品 100μL加入到检测板中；阴性对照和阳性对照各设 2孔，每孔 100μL；轻轻振匀孔中样品，置 37℃ 温育 30min。 甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板 3次， 200μL/孔，每次静置 3分钟倒掉，再在干净吸水纸上拍干。 （ 4） 加酶反应：每孔加羊抗猪酶标二抗 100μL，置 37℃ 温育 30min。 洗涤 5次 , 方法同 3。 （ 5）显色反应：每孔先加底物液 A50181。 L、再加底物液 B50181。 L，混匀，室温避光显色 10min。 （ 6）终止反应：每孔加终止 液 50μL， 10min内测定结果。 （ 7） 酶标仪检测结果： 以空白对照调零 ，酶标仪 630nm 处读取 OD 值。 （ 8） PRRS 结果判定：试验成立的条件是阳性对照孔平均 OD630 值大于或等于金陵科技学院学士学位论文 材料与方法 5 ，阴性对照孔平均 OD630 值必须小于。 样品 OD630 值大于 ，判为阳性；样品 OD630 值在 到 之间，判为可疑；样品 OD630 值小于 ，判为阴性。 (9) PR 结果判定：试验成立的条件是阳性对照孔 OD630 值应≥ ，阴性对照孔 OD630 值平均值必须低于。 样品孔 OD630 值大于 ，判为阳性；样品孔 OD630 值小于 ，判为阴性 , 样品 OD630 值在 到 之间，判为可疑。 病原检测 DNA 的提取 分别采集三头仔猪肺脏、腹股沟淋巴结及脾脏混合匀浆， 采用天净沙系列柱式动物 DNAOUT 提取试剂盒按说明书提取 DNA。 具体操作步骤如下： 取阴阳性样品及 匀浆液 各 400μL，加入 蛋白酶 K 和 50μL、浓度为10%的 SDS 溶液，混匀， 56℃ 作用 30min；依次加入 200μL氯仿和 200μL苯酚，剧烈振荡 15s，室温放置 5min； 4℃ ， 12020 转离心 10min；取上清，加入等体积的氯仿混匀，室温放置 5min； 4℃ ， 12020 转离心 10min；取上清加入 2 倍体积的无水乙醇和 1／ 10 体积、浓度为 3M的乙酸钠溶液， 20℃ 放置 30min； 4℃ ，12020 转离心 10min；弃上清，加入 75%的乙醇 1000μ L 洗涤； 4℃ ， 7500 转离心 5min；弃上清，干燥 10min；加入 15μL双蒸 水溶解沉淀并作为模板进行 PCR扩增。 RNA 的提取步骤 分别采集三头仔猪肺脏、腹股沟淋巴结及脾脏混合匀浆，采用 天净沙系列RNA 提取试剂盒按说明书提取 RNA。 具体操作步骤如下： （ 1） 取阴阳性对照记 血清 200μL，加入 1mL TrizolA 充分混匀，用匀浆仪剧烈振荡涡旋。 （ 2） 室温放置 5min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （ 3） 加入 200μL氯仿充分混匀，用手指将贴壁上的杂质弹起涡旋后，冷浴 5min。 4℃ ， 12020 r/min 离心 10min（此时液体分三层） （ 4） 取上层上清，加入等体积异丙醇，充分混匀。 （ 5） 室温放置 1520min 或 20℃ 保存（可过夜），让 RNA 沉淀下来。 4℃ ，12020r/min 离心 10min，弃掉上清液。 （ 6） 加入 1mL 75％ 无水乙醇洗涤沉淀一次。 4℃ ， 76008000r/min 离心 5min。 （ 7） 弃掉上清液，此步注意不要吸出沉淀。 超净台中风干 1520min. （ 8） 用 DEPC 水 (15μL)溶解，放在 4℃ 备用。 反转录 金陵科技学院学士学位论文 材料与方法 6 取所提 RNA 进行反转录。 反转录体系： 病毒 RNA 4 L 5 Reverse transcriptase Buffer 4L oligodT 1L RNase Inhibitor L AMV Reverse Tanscriptase 1L DEPC 水 L 总体积 20L 反转录反应条件： 65℃ 10min 42℃ 1h 95℃ 5min 立即使用或或 20℃冻存备用。 PCR 检测 根据 GenBank 登录的 CSFV, PRRSVN 基因以及 PRVgE 核苷酸序列 ,由 软件设计 PCR 引物，由上海英骏生物公司合成，其他 PCR 参数见表 1。 表 1 PCR分析引物序列及循环参数 Table1 Primer and cycle parameter used for PCR 基因 Genes 引物序列 Primer sequence(5′3′) 片段大小 Fragment size/bp 退火温度 Annealine temperature/℃ 延生时间 （ S） 循环圈数 Cycles CSFV F:5`GTCACAGCACTTAATGTGGTC 3` R: 5` CACTTACCTATGGGGTAGTGTG 3` 512 56 60 30 PRRSV F:A G CA G G A T CCA T G CCA A G T A A CA A CG G CA A G CA G R: T A A CCT CG A G T CA T G CT G A G G G T G A T G CT G T G 372 63 60 30 PRVgE F: CCCTGGACGCGAACGGCACGATG R: GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA 850 68 60 35 金陵科技学院学士学位论文 结果与分析 7 扩增完后 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。 二、结果与分析 病理变化 剖检三头发病猪，主要病理变化为：肺水肿，间质性和出血性肺炎，心包积液。 肠壁变薄，腹股 沟淋巴结被膜下出血 ，肾灰色，水肿，详细见图 3。 图 1 腹股沟淋巴结被膜下出血 图 2 肾水肿，表面有少量出血点。