g418筛选和单克隆挑取(编辑修改稿)

g418筛选和单克隆挑取(编辑修改稿)内容摘要：

蛋白质的合成而杀死细胞的。 但是新霉素对真核细胞无作用而 G418 对细菌和真核细胞都起作用。 neo 就是编码 3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和 G418。 在进行转染时细胞膜 受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上 G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3，汇合度对 G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过 50% 4， G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定 G418 的最佳筛选浓度。 具体如下：将细胞稀释到 1000 个细胞 /ml，在 100ug/ml~1mg/ml的 G418 浓度范围内进行筛选，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低 G418 浓度来进行下一步的筛选试验。 一个具体试验：3*106 个细胞电转后，分别接种 1/4000， 1/1000， 1/300 细胞到 24 孔板中， 48h后加药筛选，此时 1/300 细胞孔内大约 50%汇合度。 理论上 1/4000孔内应有 4%的汇合度。 筛选 9 天后，观察 1/4000 孔内有两三个 克隆 ，按比例 1/300 孔内应该有几十个 克隆 ，事实上，它们几乎全死光了，只有几个 克隆。 加药时间和维持浓度 1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。 所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染 24 小时之后才开始加G418 筛选。 随着细胞的代谢 G418 的浓度和活性都回下降，所以每 3~5 天都要更换一次含有 G418 的筛选液。 这时药物浓度可以降至 200ug/ml。 2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞 基因组 的抗性基因是否已经得到表达。 一般是转染 48 小时后加入抗生素。 挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的 1/2。 关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。 而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。 当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。 筛选时的培养液 加药筛选约 6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。 这时会出现两个问题：1， 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有 neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液 2 ，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。 这个时候需要一种特殊的培养液 ：假如你要转染 3T3 细胞，在 3T3细胞汇合度达到 80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按 1： 1 混合备用。 再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。 3，适当增加血清浓度。 筛选时出现的问题及其解决办法： 1， 问题 1。 做 hela 细胞的筛选，现在已经筛选 3 周，在 6 孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到 96 孔板中，就用 2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去 了，该怎么办。 a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用 37 度温箱预热，并且 PBS 润洗细胞层，以减少可能残存的血清的影响； b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到 37度温箱中继续作用 1MIN，这时，消。