青霉素发酵操作手册b5(编辑修改稿)

青霉素发酵操作手册b5(编辑修改稿)内容摘要：

手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 7 将细胞冻结，并保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华致干。 在此环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，故可长时间保存，一般为5～ 10 年，最多可达 15 年之久。 此法兼备了 低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的设备。 孢子的制备 这是发酵工序的开端，是一个重要环节。 抗生素产量和成品质量同菌种性能以及同孢子和种子的情况有密切关系。 生产用的孢子需 经过纯种和生产能力的检验，符合规定的才能用来制备种子。 保藏在砂土管或冷冻干燥管仲的菌种经无菌手续接入适合于孢子发芽或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面。 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基孢子，孢子可直接作为中子罐的种子。 种子制备 种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程 ，其 目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。 种子制备所使用的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。 种子 罐级数是在指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。 青霉素种子制备一般为二级种子罐扩大培养。 发酵培养基 介绍 培养基是供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。 青霉素的发酵培养基由碳源、氮源、无机盐及金属离子、添加前体、消沫剂五部分组成。 青 霉素生产仿真使用 手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 8 碳源的主要作用是：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；为合成目 的产物提供所需的碳成分。 青霉素发酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。 其中乳糖最为便宜，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。 但当葡萄糖浓度超过一定限度时，会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致 pH 下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长河产物的合成。 氮源的作用是供应菌体合成氨基酸和三肽的原料，以进一步合成青霉素。 主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。 玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气 及氧的传递，因而利用率较高。 固体有机氮源原料一般需粉碎至 200 目以下的细度。 有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。 无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量使用。 碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的 pH 值，为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。 另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。 由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。 发酵时间愈长，则铁离子愈多。 铁离子在 50181。 g/ml 以上便会影响青霉素的合成。 采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实际对青霉素 产量并无改进。 所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜，其他重金属离子如铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反应。 添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素 G 的生产强度，添加苯氧乙酸则产生青霉素 V。 因此前体的加入成为青霉素发酵的关键问题之一。 但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。 也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。 而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。 前体要在发酵开始 20h 后加入，并在整个发酵过程中 控制在 50181。 g/ml 左右 青 霉素生产仿真使用 手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 9 由于在发酵过程中二氧化碳的不断产生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌的后果。 采用植物油消沫仍旧是个好方法，一方面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作用，但现在已普遍采用合成消沫剂（如聚酯、聚醇类消沫剂）代替豆油。 灭菌 “灭菌”指的是用化学或物理的方法杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺流程。 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶 化、消失的现象。 工业上常用的方法有：干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种。 在青霉素的生产中，对培养基和发酵罐主要采用的是湿热蒸汽灭菌和空气过滤除菌的方法。 发酵 这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。 发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。 接种量一般为 5～ 20%。 发酵周期一般为 4～ 5 天，但也有少于 24 小时，或长达二周以上的。 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化分析和无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生 情况和有无杂菌污染。 发酵的过程控制 碳源控制 ： 青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。 乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄青 霉素生产仿真使用 手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 10 糖也是比较好的碳源，但必须控制其加入的浓度，因为葡萄糖易被菌体氧化并产生抑制抗生素合成酶形成的物质，从而影响青霉素的合成，所以可以采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖。 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素G 的侧链前体。 菌体对前体的利用有两个途径：直接结合到产物分子中或作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。 前体究竟通过哪个途径被菌体利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。 通过比较苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取决于培养基的 pH 和前体的浓度。 碱性时，苯乙酰胺有毒；酸性时，苯乙酸毒性较大；中性时，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。 前体用量大于 %时，青霉素的生物合成均下降。 所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在 %为宜。 在碱性条件下，苯乙酸被菌体氧化的速率随培养基 pH 上升而增加。 年幼的菌丝不氧化前体，而仅利用它来构成青霉素分子。 随着菌龄的增大，氧化能力逐渐增加。 培 养基成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少。 为了尽量减少苯乙酸的氧化，生产上多用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的方法，以保持前体的供应速率略大于生物合成的需要。 pH 控制 ： 在青霉素发酵过程中， pH 是通过下列手段控制的：如 pH过高，则添加糖、硫酸或无机氮源；若 pH 过低，则加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。 另外，也可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液 pH 维持在 ～ ，以提高青霉素产量。 温度控制 ： 青霉菌生长的适宜温度为 30℃，而分泌青霉素的适宜温度是 20℃左右，因此生产上采用变温控制的方法，使之适合不同阶段的需要。 一般一级种子的培养温度控制在 27177。 1℃左右；二级种子的培养温度控制在青 霉素生产仿真使用 手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 11 25177。 1℃左右；发酵前期和中期的温度控制在 26℃左右；发酵后期的温度控制在 24℃左右。 补料控制 ： 发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及 pH 外，补加氮源也可提高发酵单位。 经试验证实：若在发酵 60～ 70h 开始分次补加硫酸铵，则在 90h 后菌丝含氮量几乎不下降，维持在 6%～ 7%，且 60%～ 70%的菌丝处于年幼阶段，菌丝呼吸强 度维持在二氧化碳量近 30μ l/（ mg 菌丝 h），抗生素产率为最高水平的 30%～ 40%；而不加硫酸铵的对照罐，在发酵中期菌丝含氮量为 7%，以后逐级下降。 至发酵结束时为 4%。 发酵结束时呼吸强度降至二氧化碳量为 16μ l/（ mg 菌丝 h），且抗生素产量下降至零，总产量仅为试验罐的 1/2。 因此，为了延长发酵周期，提高青霉素产量，发酵过程分次补加氮源也是有效的措施。 铁离子的影响 ： 三价铁离子对青霉素生物合成有显著影响，一般若发酵液中铁离子含量超过 30～ 40μ g/ml，则发酵单位增长缓慢。 铁离子对产黄青霉绿色孢子合成 青霉素的影响见下表。 因此铁罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使铁离子含量控制在 30μ g/ml 以下。 防止染菌的要点 染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。 影响染菌的因素很多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是可以防止的。 请到左边的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。 空气系统的要求 防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度，防止空气夹带油和水及空气过滤器失效。 提高空压机进口空气的洁净度，可以从提高吸气口的位置及加强空气 的压缩前过滤着手。 防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进青 霉素生产仿真使用 手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 12 入空气系统。 蒸汽系统的要求 重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动，保证生产时所用的蒸汽压力在 30～ 35 千帕以上。 连续灭菌设备 ： 连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混合均匀，并易于控制温度。 发酵罐 ： 发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。 凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必须保 证严密度。 无菌室 ： 用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。 青 霉素生产仿真使用 手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 13 第三章 提炼工艺过程 发酵液中的杂质如高价无机离子（ Fe2+、 Ca2+、 Mg2+）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸收。 如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒合水相分离困难。 对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。 如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。 如加磷酸（或磷酸盐），既能降低钙离子浓度，也利于去除镁离子。 Na5P3O10 + Mg2+====MgNa3P3O1 0+ 2Na+ 加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。 此外，两者还有协同作用。 他们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。 2K4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 K2Zn[Fe(CN)6]2 + 2Na+ 为了有效的去除发酵液中的蛋白质，需加入絮凝剂。 絮凝剂是一种能溶于水的高分子化合物。 含有很多离子化基团（如 — NH2， — COOH， — OH）。 化学提取和精制的目的：从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成 品。 由于发酵液中 青霉素 浓度很低，仅 ～ %左右，而杂质浓度比 青霉素 的高几十倍甚至几千倍，并且某些杂质的性质与抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。 发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、预处理需要加入的杂质等。 青 霉素生产仿真使用 手册 地址：北京市朝阳区安外小关东里 10 号院，润宇大厦 610 室 邮编： 100029 Email: 电话： 010－ 64951832 网址： 14 在提炼过程中要遵循下面四个原则： 时间短 温度低 pH 适中 勤清洗消毒 常用的提取方法有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。 溶媒萃取法 这是利用 抗生素 在不同的 pH 值条件下以不同的化学状态（游离态、 碱或盐 ） 存在时，在水 及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使 抗。