广东省自然科学基金项目c-maf调控il-4参与多发性硬化发病的分子机制研究申请书(编辑修改稿)

广东省自然科学基金项目c-maf调控il-4参与多发性硬化发病的分子机制研究申请书(编辑修改稿)内容摘要：

ollageninduced arthritis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 20xx。 40:116124. 14 Noble A, Thomas MJ, Kemeny DM: Early th1/th2 cell polarization in the absence of il4 and il12: T cell receptor signaling regulates the response to cytokines in cd4 and cd8 t cells. Eur J Immunol 20xx。 31:22272235. 15 Nan CL, Lei ZL, Zhao ZJ, Shi LH, Ouyang YC, Song XF, Sun QY, Chen DY: Increased th1/th2 (ifngamma/il4) cytokine mrna ratio of rat embryos in the pregnant mouse uterus. J Reprod Dev 20xx。 53:219228. 8 三、研究方案 １ . 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究目标： （ 1） 明确 cMaf 和 IL4 在多发性硬化中的表达特性及其表达失调对多发性硬化发病的影响。 （ 2） 阐明 cMaf通过组蛋白去甲基化 调控 IL4 表达参与多发性硬化发病的分子机制。 研究内容： （ 1）明确 cMaf 和 IL4 在多发性硬化病人的血液和脑脊液 PBMC 中的表达特性 采用荧光定量 RTPCR、 western blot 以及免疫荧光双标法检测 多发性硬化病人的血液和脑脊液 PBMC 中 cMaf 和 IL4 的表达特性，分析 两 者在正 常与 MS 免疫细胞中 的相关性表达。 同时，检测 PBMC 中 IL4 启动子区 CpG 岛的 去 甲基化程度以及与 多发性硬化的 相关性。 （ 2）探讨 cMaf 和 IL4 表达失调对多发性硬化发病的影响 分别通过过表达和 RNA 干扰改变 cMaf 和 IL4 表达水平，观察其对多发性硬化PBMC 细胞活力和免疫特性的影响。 （ 3） 检测 cMaf 对 IL4 启动子区组蛋白 去 甲基化和 CpG 岛 去 甲基化的影响 建立稳定过表达 cMaf 的鼻咽癌细胞株，首先通过荧光素酶报告基因检测 cMaf 能否抑制 IL4 的转录，然后通过免疫共沉淀检测 cMaf、 EHR 和 MAREs 是否存在相互作用形成复合体，接着利用染色质免疫共沉淀（ chromatin immunoprecipitation, ChIP）检测cMaf、 EHR 和 MAREs 与 IL4 启动子区结合以及组蛋白发生 去 甲基化 反应 ，最后采用亚硫酸氢盐修饰后测序法（ bisulfite genomic sequencing PCR, BSP）检测 IL4 启动子区 CpG岛的甲基化，明确 cMaf 通过招募一系列效应蛋白形成复合体 使 IL4 启动子区的组蛋白甲基化， 以 进一步 明确 组蛋白 去 甲基化是否引起 IL4 启动子区 CpG 岛 去 甲 基化，从而揭示 多发性硬化 中 IL4 基因表达受抑制的分子机理。 拟解决的关键科学问题： 问题一： 如何 鉴定 cMaf 和 IL4 在 多发性硬化 中呈相关性表达是 阐明 cMaf调控 IL4 参与 多发性硬化发病 分子机制的 前提。 本项目 一方面 将 通过荧光定量RTPCR 和 western blot 检测 血液和脑脊液 PBMC 中 两者的表达水平，通过统计学分析证实其相关性表达，另一方面将通过免疫荧光双标记法分别标记 cMaf 和 IL4，将 PBMC 9 爬片进行激光共聚焦扫描，进行精确的定位定量分析，从形态学上直接证实两者的相关性表达。 问题二： 如何证实 cMaf 通过招募其他效应蛋白组成复合体引起 IL4 启动子区组蛋白甲基化从而抑制转录 的。 本项目将利用荧光素酶报告基因实验直接证实cMaf 对 IL4 的转录抑制作用，然后通过免疫共沉淀、 ChIP 以及检测甲基化的相应实验方法，明确 cMaf、 EHR 和 MAREs 是否 与 IL4 启动子区结合以及组蛋白 是否 发生 去 甲基化 反应 ，并检测该组蛋白修饰是否引起 IL4启动子区 CpG 岛 去 甲基化从而 导致 转录抑制。 10 ２ . 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 拟采取的研究方案： （ 1）明确 cMaf 和 IL4 在多发性硬化病人的血液、脑脊液及 PBMC 细胞株中的相关性表达（部分已完成） ① 检索我们的 MS 患者资料库，选取确诊为多发性硬化病人的血液和脑脊液标本 60例；收集正常人血液和脑脊液标本 60 例。 ② 细胞培养：体外培养 人 和大鼠 外周血单个核细胞（ PBMC） 株。 ③ 抽提两种细胞株及多发性硬化病人血液和脑脊液标本的小分子 RNA、总 RNA 和总蛋白，通过荧光定量 RTqPCR 和 western blot 分别检测 cMaf 和 IL4 在多发性硬化病人的血液和脑脊液中的表达差异。 ④ 采用免疫荧光双标技术 和 激光共聚焦显微镜扫描成像 技术 观察 PBMC 中 cMaf 和IL4 的共定位情况。 实验按常规方法进行，具体步骤如下：已固定的 PBMC 细胞爬片经血清封闭后，使用 mouse anti IL4 antibody（ sc28361）和 rabbit anticMaf antibody（ sc7866）同时进行一抗孵育， PBS 缓冲液洗片后用不同标记的二抗即 Alexa Fluor 555conjugated antirabbit antibody（ CatCST4413）和 Alexa Fluor 555conjugated antimouse antibody（ CatCST4408）同时孵育，充分洗片后封片观察，应用激光共聚焦显微镜扫描成像。 ⑤ 统计学分析 cMaf 和 IL4 在正常 人与 MS 患者多发性硬化病人的血液、脑脊液及PBMC 细胞株中 的 相关性表达。 ⑥ 抽提 PBMC 基因组 DNA，亚硫酸氢钠修饰后进行纯化回收，根据文献报道设计IL4 启动子区引物进行 PCR 扩增，随后将 PCR 产物与 T 载体连接、转化和蓝白斑筛选，然后挑克隆送测序，根据测序结果判断 PBMC中 IL4启动子区 CpG 岛是否发生 去 甲基化，并结合标本 对应的 临床资料，分析该基因异常甲基化与 多发性硬化 的相关性。 （ 2）探讨 cMaf 和 IL4 表达失调对多发性硬化发病的影响 ① 利用美国 Invitrogen 公司网站设计软件在线设计并合成针对鼠源性 cMaf 和 IL4基因的小干扰 RNA（ siRNA），同时合成阳性对照和阴性对照。 ② 查询 GenBank 数据库获得 cMaf 和 IL4 的 CDS 区全长，分别设计上、下游引物，上、下游引物 5’端分别引入 Kpn I 和 EcoR I 限制性内切酶位点，以正常人基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增产物经 TA 克隆和测序证实后，通过 Kpn I 和 EcoR I 酶切位点 11 定向克隆到 pcDNA4 真核细胞表达载体， 然后 对重组质粒 pcDNA4/cMaf 和 pcDNA4/ IL4进行双酶切和测序鉴定。 ③ 将 cMaf siRNA 和 pcDNA4/cMaf 利用靶向纳米材料 分别转染 PBMC 细胞株，经RTPCR 和 Western blot 检测 cMaf 表达变化，同时检测 cMaf 的表达改变对 IL4 表达的影响，观察两者是否成正相关。 ④ 将 IL4 siRNA 和 pcDNA4/ IL4 分别转染 PBMC 细胞株，观察 IL4 表达改变对免疫相关细胞因子（如 IL1 IFNγ 和 IL2 及 IL IL5 和 IL6）分泌的影响。 （ 3）证实 cMaf 通过引起 IL4 启动子去甲基化启动该基因的转录 ① PCR 扩增 IL4 基因上游 区域的基因组序列，克隆到 pGL3 荧光素酶报告基因载体，重组质粒经鉴定正确后，转染 PBMC/cMaf 细胞株，通过检测荧光素酶活性的改变，证实 cMaf 与 IL4 启动子区结合且发挥转录启动作用。 ② 按照免疫共沉淀 试剂盒 说明书操作，进行免疫共沉淀实验，即采用 RIPA buffer温和 裂解 PBMC/cMaf 细胞 ， 抽提蛋白后进行定 量，向稀释后的总蛋白中加入 cMaf 抗体，将抗原抗体复合物进行孵育，然后利用试剂盒的 AminoLink Plus Coupling Resin 捕捉抗原抗体复合物，将沉淀下来的蛋白复合体进行 western blot，通过 cMaf、 EHR 和 MAREs的相应抗体检测三者之间是否存在相互作用。 ③ 按照试剂盒说明书操作，进行 ChIP 实验，即用甲醛处理 PBMC/cMaf 细胞使蛋白和 DNA 发生交联，交联后的染色质采用超声剪切法，产生较小的 DNA 片段，并预先纯化以降低非特异性免疫沉淀，随后用 cMaf、 EHR 和 MAREs 抗体分别进行免疫沉淀。 采用 Protein A/G PLUS Agarose 琼脂糖树脂洗脱蛋白 DNA 复合物，加热样品取消交联，纯化出 DNA 片段，然后进行 PCR 扩增分析，检测 cMaf、 EHR 和 MAREs 是否均与 IL4启动子区结合以及 启动子区组蛋白是否发生 去 甲基化修饰。 ④ 采用 BSP 法检测 IL4 启动子区 CpG 岛是否发生去甲基化修饰，具体步骤如下：抽取 PBMC/cMaf 基因组 DNA，采用亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA，然后将修饰后的 DNA进行纯化回收，根据文献报道设计引物进行 PCR 扩增，随后将 PCR 产物 与 T 载体连接、转化和蓝白斑筛选，然后挑克隆送测序 ，根据测序结果判断 CpG 岛是否发生甲基化。 ⑤ 分别采用 DNA 甲基 转移 酶抑制剂 5氮杂 2脱氧胞苷（ 5AzaCdR）和 HDAC 抑制剂 SAHA 处理 稳定过表达 cMaf 的 PBMC/cMaf，然后检测 cMaf mRNA 和蛋白水平的表达是否发生改变，进一步验证 cMaf 能否通过 DNA 去甲基化促进 IL4 的表达。 （ 4）统计学方法 12 数据拟采用 软件进行统计处理，计量资料采用 sx 表示，计数资料采用百分率表示， 分别采用 t 检验、方差分析比较均值间的差异，计数资料则采用卡方检验。 两变量间的相关性采用直线相关和回归评价，多变量间的相关性关。