2006省基金项目申请-卵巢上皮性癌的间皮素mesothelin)表达及与ca125的功能关系(编辑修改稿)

2006省基金项目申请-卵巢上皮性癌的间皮素mesothelin)表达及与ca125的功能关系(编辑修改稿)内容摘要：

变化的意义，并探讨 MSLN和 CA125互补应用的价值。 对有腹水的患者，分析腹水中 MSLN的浓度。 3． 用免疫荧光法分析一些卵巢癌细胞系的 MSLN 和 CA125 的表达定位。 用双重荧光标记借助共聚焦显微镜观察 MSLN和 CA125的定位和共表达情况。 4． MSLN和 CA125对卵巢癌细胞生长、增殖和凋亡的影响。 5． 卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验：降调 MSLN和 CA125 蛋白质的表达，将已经降调了 MSLN和CA125 的 卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对照，进行体外卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验，观察 MSLN和 CA125对人体卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞黏附的影响。 6． 异种细胞黏附实验：由于迄今仅有鼠的 MSLN 的封闭抗体，所以本课题应用异型细胞黏附实验观察在表达 MSLN和 CA125的细胞间的黏附过程中 MSLN所起的作用。 7． 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型：将表达 MSLN和 CA125和被降调了 MSLN和 CA125表达的卵巢癌细胞注入雌裸鼠的腹腔，建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，观察 MSLN 和 CA125 在人卵巢 癌转移过程的作用。 研究目标： 用分子生物学、细胞生物学和免疫组织学技术，分析间皮素（ mesothelin, MSLN）在临床各期卵巢癌患者的血清、腹水、组织标本中的分布表达，探讨 MSLN 与卵巢癌临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系、与传统指标 CA125 表达及定位的关系，最终总结 MSLN 是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物， MSLN 是否可以和 CA125 互补应用于卵巢癌的诊断和病情监测。 初步探讨MSLN 的在卵巢癌细胞生长增殖、黏附和腹腔种植转移的作用，揭示 MSLN 与 CA125 的功能关联性，为 卵巢癌独特的腹腔生长转移行为提供理论依据，为抗腹腔转移治疗打下基础。 拟解决的关键问题： 1 目前尚无系统研究 MSLN 用于卵巢癌的诊断和病情监测的报告，因此，本研究要解决的首要问题是MSLN 是否有作为卵巢癌的诊断标记物的价值。 这一问题的解决也为今后研究 MSLN 对子宫内膜异位症等与腹膜间皮细胞有关的疾病的诊断价值打下基础。 2 最新研究提示（ 20xx 年 3 月）人 CA125 是鼠 MSLN 受体，因此，研究人体细胞 MSLN 和 CA125 的表达定位关系及其与卵巢癌疾病状态的关系非常重要。 在明确这一问题的基础上，将为临床 互补使用这两个指标提供理论依据。 3 卵巢癌的主要转移途径是直接在腹腔的腹膜种植形成转移灶，腹膜间皮是人体表达 MSLN 的主要细胞。 卵巢癌细胞恶性转化后同时出现 CA125 和 MSLN，而 CA125 可能是 MSLN 的受体。 这一重要线索提示二者可能与卵巢癌的腹腔转移有关。 通过体外细胞的黏附实验和裸鼠动物模型的研究，阐明MSLN 在 CA125 在这一过程的作用，为理解卵巢癌转移方式提供理论依据，并可为开发抗肿瘤转移新药提供新的思路和药物作用靶。 预期研究结果： 1． 本课题经过 3 年左右的研究，将对 MSLN 在卵巢癌诊断（含早期诊断 ）和病情监测的价值基本得出结论，如结论是肯定的，对卵巢癌的临床实践有重要的意义。 这一成果可达到国际先进水平。 2． 阐明 MSLN 和 CA125 的表达关系， MSLN 将可以与 CA125 联合用于临床实践，使得医师更准确地判断病情。 3． 完成观察 MSLN 和 CA125 共同作用对细胞黏附和癌的转移的影响的研究，将可以深入理解二者的功能，理解癌腹腔转移的分子机制，为开发新的抗癌药提供理论依据。 4． 本课题的完成，将撰写和投稿国外 SCI 期刊文章 3— 4 篇，国家级期刊 4— 6 篇，申报国家级成果一项，省级成果 2— 3 项。 五、拟采取的研究方法和技 术路线 (包括理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性分析、创新处；研究 工作的总体安排和年度进度 ) 拟采取的研究方案 : 1． MSLN 在组织中的表达分析： 用 RTPCR 和免疫组织化学的方法分析来自正常卵巢 表面上皮 、卵巢良性上皮性肿瘤和临床各期的卵巢癌的手术切除标本的 MSLN和 CA125的表达，观察 ⑴ MSLN的表达阳性率和定位； ⑵ MSLN和 CA125 的共表达状况； ⑶ 对出现 MSLN和 CA125 共表达的标本，用 MSLN和 CA125的抗体双重标记，借助免疫荧光技术用激光共聚焦显微镜，分析二者在细胞的定位是否重叠，即 形态学上寻找 MSLN和 CA125结合的证据。 2． MSLN 的血清学和腹水检测：用 ELISA 法检测来自 健康妇女和与 1 项中同源的卵巢良性上皮性肿瘤和临床各期的卵巢癌患者血清中的 MSLN，⑴由健康妇女来源的数据确定 MSLN 的正常值范围，以 此作为基线观察肿瘤患者血清中 MSLN的水平；⑵分析 MSLN的水平与临床分期和组织学分类的关系；⑶观察手术切除肿瘤前后和化疗后 MSLN的变化、肿瘤复发时 MSLN的值的改变；⑷对上述人群同时监测血清 CA125的水平，与组织细胞的 MSLN和 CA125的表达状况相联系，观察 MSLN的过度表 达是否会影响癌组织 CA125的释放和血清 CA125的水平；⑸检测腹水中 MSLN和 CA125的水平， 并与血清的浓度比较，结合组织细胞的表达状况，分析 MSLN 的释放和循环规律。 在总结上述 1 和 2 项的基础上，最终总结 MSLN 是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物， MSLN 是否可以和 CA125 互补应用于临床理解和判断卵巢癌疾病状况。 3． 卵巢癌细胞系的 MSLN 分析：以阳性表达 MSLN 的卵巢上皮性囊腺癌细胞 OVCAR3 为对照，检测卵巢浆液性囊腺癌（ SKOV3）、黏液性囊腺癌（ 3AO）、透明细胞癌（ TOV21G） 3 株细胞系中的MSLN 和 CA125 的表达和定位。 同时分析培养液中 MSLN 和 CA125 的水平。 用双重荧光标记借助共聚焦显微镜观察 MSLN 和 CA125 的定位和共表达情况。 4． MSLN 和 CA125 对卵巢癌细胞生长和增殖的影戏：用 MSLN 和 CA125 的反义寡聚核苷酸或 RNA干扰技术（ RNA interference, RNAi）降调卵巢癌细胞系中 MSLN 和 CA125 的表达，用流式细胞术和 Western blot 证实降调后，将已经降调了 MSLN 和 CA125 的卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对 照，用细胞克隆形成率、 MTT 法、流式细胞术等观察 MSLN 和 CA125 对卵巢癌细胞生长、增殖能力和细胞凋亡的影响。 5． 体外卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验：用 MSLN 和 CA125 的反义寡聚核苷酸或 RNA 干扰技术降调卵巢癌细胞系中 MSLN 和 CA125 表达，将已经降调了 MSLN 和 CA125 的卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对照，进行黏附实验。 手术中取人卵巢癌患者的腹水，分离得到腹水中腹膜间皮细胞，体外原代培养腹膜间皮细胞，将间皮细胞加入培养板的孔内；用 51Cr标记 4 株卵巢癌细胞系，将标记后的细胞系 置于包被了间皮细胞的培养孔内， 37OC 培养 30 分钟，细胞黏附在此间发生，用 γ记数器探测放射活性，计算细胞的黏附率。 该实验探讨 MSLN 及其可能的受体 CA125在卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞黏附过程中的作用。 6． 异型细胞黏附实验：由于至今尚无人 MSLN 的封闭抗体，所以本课题应用异型细胞黏附实验观察同时表达 MSLN 和 CA125 的人卵巢癌细胞与表达 MSLN 的鼠内皮样细胞 LO 的黏附率，并用针对鼠MSLN 的封闭抗体 B35 封闭 LO 细胞后，观察异型细胞的黏附率的变化。 该实验进一步分析 MSLN和 CA125 在细胞黏附过程中的作用。 7． 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型：将 OVCAR3 细胞以 10 106/个浓度注入雌裸鼠的腹腔，建立卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型， 5 周后记数腹腔转移灶的数目。 此为对照组。 用 MSLN 的反义寡聚核苷酸或 RNA 干扰技术（ RNA interference, RNAi）分别降调 MSLN 和 CA125 蛋白质的表达，用流式细胞术定量分析蛋白质表达量后，将已被降调了 MSLN 和 CA125 的 OVCAR3 细胞分别注入雌裸鼠的腹腔（ 10 106/个）， 5 周后将两个实验组与对照组比较，记数实验组腹腔转移灶数目。 该实验在体内实验的基础上探讨 MSLN 和 CA125 对卵巢癌腹腔转移形成的作用。 可行性分析 ： 1． 我们课题组多年从事卵巢癌的基础研究，主要集中在卵巢癌的早诊和癌的侵袭转移等方面。 20xx年，申请人采用高通量的基因芯片技术，用含人 8000 条基因的 DNA 微阵列分析了卵巢癌的基因表达谱，发现了 56 条上调和 23 条下调的基因， 79 条表达差异的基因中，其中，间皮素（ mesothelin, MSLN）的变化最为显著，位于 79 条基因之首，在卵巢癌中显著上调表达。 随后，对用于 DNA 微阵列的标本，我们用半定量 RTPCR 和免疫组织化学方法进行了 MSLN 的表 达检测，初步验证了符合芯片杂交的结果。 我们的前期工作使得我们避免了选题上的盲目性，也为课题达到预期的研究目标打下了客观的基础。 2． 由于目前尚无 MSLN 的特异封闭抗体，故本研究拟用 RNAi 和反义寡聚核苷酸技术降调 MSLN。 短的双链 RNA 可特异性的降调或消除与其序列同源的基因的表达，可下调相应功能蛋白质的表达，这一现象被成为 RNA interference 或 RNAi。 具体应用中用仔细设计的 21 个碱基的双链 RNA，借助转染方式被导入哺乳细胞内，可失活与其任一链序列同源的基因的功能，与其他降调基因技术（如反义核酸等） 相比降调高效。 申请人 20xx 年在英国 ICRF（帝国癌症基金，现 Cancer Research UK）工作时多次使用该技术，使得本课题应用这一新技术得到保证。 3． 申请人于 20xx 年在英国 ICRF 参研“肿瘤细胞中整合素介导的蛋白质水解作用与肿瘤的侵袭和转移”（至今英国 ICRF 的研究者未完成该项目）中部分内容，曾长期使用激光共聚焦显微镜观察活的瘤细胞膜的蛋白水解的动态过程，因此，具有熟练应用激光共聚焦显微镜的能力。 4． 医院是省肿瘤防治中心，申请人所在的妇科是省妇科肿瘤医疗、教学和科研重要基地，是医科大学首个培养妇科肿 瘤专业博士研究生教学点。 每年住院手术治疗的妇科肿瘤患者达 3000 多例，其中，卵巢肿瘤患者约 1000 多例。 对所有治疗的病例，病案资料齐全，对恶性肿瘤患者，有专人登记和随访。 因此，我们有充足的研究所需的标本和病例资料，使进行此项研究得到保证。 5． 肿瘤研究所、省肿瘤研究重点实验室均附设在医科大学医院，有较好的开展分子生物学、肿瘤细胞生物学等研究的条件，拥有超低温冰箱、实时定量 PCR 仪、凝胶成像系统、 γ 记数仪、激光共聚焦显微镜（医科大学药理教研室）、 DNA 测序仪、动物中心等开展此项目的必备设备和条件。 主要申请人有肿瘤 学、病理学、癌的侵袭转移生物学、细胞生物学和分子生物学等丰富的研究经验，故申请单位有充足信心和能力完成并达到预期研究目的。 本项目的特色与创新之处： 1． MSLN 的基因在人体卵巢癌组织中上调表达的研究报道，仅有 20xx 年 8 月的美国一篇报道，与我们用基因芯片筛查的研究同步，但美国学者没有对该指标进行后期的验证工作，而这一步分析是芯片杂交结果的必需部分。 我们不仅发现了 MSLN 基因在卵巢癌组织中的上调显著，还在基因和蛋白质水平验证了芯片的结果。 截止到本申请撰写时，国内未见 MSLN 的研究报道。 本课题的选题具新颖 性。 2． 本组在 MSLN 的临床应用价值方面率先开始系统的研究。 MSLN 用于卵巢癌诊断指标的研究也仅有一项美国的研究报道，且尚未完成。 国内未见相关报道。 3． CA125 已经长期应用于临床实践，根据 20xx 年 12 月的最新的研究报道启示，在本研究中我们将MSLN 的表达与 CA125 的表达相联系，试图发现其内在联系，如能达到预期的目的，不仅为临床实践提供价值很高的参数，也将为研究 MSLN 和 CA125 的功能开辟新的途径。 4． 本研究根据最新的实验研究结果和合理地科学推测，设计进行 MSLN 和 CA125 对卵巢癌细胞黏附的影响的实验研究 ，尤其是结合卵巢癌的独特转移规律，研究 MSLN 和 CA125 对卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞（表达 MSLN）的黏附的影响，在此基础上拟建立动物模型观察 MSLN 和 CA125 在体内对卵巢癌转移的作用。 结果将对理解癌腹腔转移的分子机制和开发新的抗癌药提供理论依据，这一思路在国内外均未见报道。