油茶(camellia_oleifera_abel)三萜皂苷的分离纯化毕业论文(编辑修改稿)

油茶(camellia_oleifera_abel)三萜皂苷的分离纯化毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

油茶三萜皂苷 （ 1） 配制洗脱液：二氯甲烷：甲醇：水 =65:50:8。 （ 2） 装柱：称取硅胶（ 100200 目），柱 ③ (100 cm) 478 g、柱 ④ (100 cm) 522 g，分别用适量洗脱液浸泡并搅拌均匀赶出气泡。 装柱前先在柱内倒入部分洗脱液作为缓冲，装柱时要一气呵成，否则会有断层。 分别量取 2500 ml 的洗脱液循环冲柱，使硅胶压的更紧实，最终硅胶柱高约 80 cm。 （ 3） 拌样：各称取 15 g 样品 A 于小烧杯中，加少量甲醇溶解，再各称取 15 g 硅胶于研钵中，放于水浴锅（ 60℃ ）上， 将溶解的样品缓慢倒入并搅拌均匀，加热后得到干物质共 63 g，研成粉末。 （ 4） 湿法上样： 将上步研磨得到的粉末装柱， 柱 ③ g、柱 ④ g，再 7 在样品上各加 10 g 硅胶，防止倒入缓冲液时冲起样品。 注意硅胶和样品的铺面一定要平整，这样 才能使样品中的洗脱物 均匀下沉。 （ 5） 洗脱：待含颜色的物质接近旋钮口时开始收集流出液（每 500 ml 一组），并做好标注。 （ 6） 干燥：每组分别进行旋转蒸发，直到流出液蒸发后无明显物质为止，每根柱子各冲出 15 个组分。 最后将所有组分水浴浓缩、冷冻干燥得样品 B。 （ 7） 点板 显色：从中选出质地均匀、颜色较浅的组分，各取少许经甲醇溶解后用毛细管吸取适量点在硅胶板一侧，注意点的大小和颜色，各组分所点的大小要均匀一致，点的颜色较浅时要多点一些。 用吹风机吹干后将硅胶板放于装有缓冲液（二氯甲烷：甲醇：水 =65:50:8）的密封瓶中层析，再次吹干后均匀地喷上显色剂，最后放于电热鼓风恒温干燥箱中以 120℃ 加热显色约 1 min。 显色剂的配制：称取 g 硫酸铈溶于 50 ml 浓度为 10%的硫酸溶液中。 观察显色程度，用作分组参考。 硅 胶柱二次分离油茶三萜皂苷 （ 1） 装柱：在样品 B 中， 每根柱子的 2 号组分质量最多且质地均匀、色泽较浅，柱 ③ 2 为 g、柱 ④ 2 为 g。 重装两根硅胶柱（柱 ⑤ 、柱 ⑥ ），每根柱用 430 g 硅胶（ 200300 目）。 （ 2） 洗脱：缓冲液配制为二氯甲烷：甲醇：水 =65:50:6，装柱后用缓冲液洗脱柱子，待硅胶柱压紧实后测得两根柱子都高约 72 cm。 （ 3） 湿法上样：分别将柱 ③ 柱 ④ 2 组分 用甲醇溶解，经有机膜过滤后各用 7 g 硅胶拌样， 分别 上样 后每根柱子加 10 g 保护 硅胶。 （ 4） 干燥：用缓冲液冲至流出液经旋转蒸发后无明显物质为止，旋转蒸发、冷冻干燥后 ，柱 ⑤ 得 9 个组分（共 g）、柱 ⑥ 得 8 个组分 (共 g)。 （ 5） 液相分析：挑选色泽较白、质地均匀的组分进行液相分析。 ODSC18OPN 分离纯化油茶三萜皂苷 （ 1） 样品 选择 ：经液相分析后，通过观察比较各组分样品的液相图进行分组，将柱 ⑤ 3 至 ⑤ 7 和柱 ⑥ 1 至 ⑥ 7 合并（共 g）。 防死吸附：用甲醇溶解，经滤纸抽滤和有机膜过滤后先 用少量 C18 分离 ，防止死吸附现象，避免污染后面的整根 ODSC18OPN 柱，以纯甲醇为洗脱液，将流出液进行蒸发浓缩、有机 8 膜过滤 后 得到备 用样品溶液（ 60 ml）。 （ 2） 装柱：将 C18( g） 装柱，先用纯甲醇冲 洗 柱 子 使其更加紧实，再用 50%浓度的甲醇将柱内纯甲醇置换出，将样品溶液分四次上样。 （ 3） 洗脱：分别用 50%、 60%、 65%、 70%、 100%浓度的甲醇梯度洗脱，每梯度 400 ml，将柱 ⑤ 、柱 ⑥ 剩余组分合并作为第 5 次上样，每次上样前 需 将ODSC18OPN 柱冲成 50%的甲醇浓度 ， 从而使柱内溶液浓度与第一个洗脱梯度的浓度相同， 各 收集 5 个组分。 （ 4）干燥： 将最终冲出的 25 个 组分别进行 旋转 蒸发 、 水浴锅浓缩和 冷冻干燥 后得到样品 C。 （ 5）液相分析： 将 得出的 固体 组分 进行 液相分析 ，得到的液相分析图 作 为下一步中样品选择的依据。 ODSC18OPN 二次分离纯化油茶三萜皂苷 （ 1） 样品合并：从样品 C 中选出组分 1 2 3 44 合并（共 g），并用甲醇溶解，有机膜过滤。 （ 2） 洗脱：将上步所用的 ODSC18OPN 柱 用 50%的甲醇 饱和 ，上样后分别用 60%(450 ml)、 65%（ 600 ml）、 100%（ 600 ml）浓度的甲醇梯度洗脱，流出液需分组收集， 60%的流出液全部收集为一组； 65%的流出液分 3 组收集 ，每组 200 ml； 100%的先收 200 ml ， 剩余的为一组，共得出 6 个组分。 （ 3）干燥： 将所得的 6 个 组分经旋转蒸发、冷冻干燥后共得 g 样品。 （ 4）各组分的 HPLC 分析。 HPLC 分离纯化 通过观察经 ODSC18OPN 柱分离纯化后所得组分的液相分析图判断油茶三萜皂苷的分离纯化程度，选择峰 较明显、峰的数量较少的组分 进一步进行 HPLC分离纯化。 HPLC 条件： Aglilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm mm, 5 μm)色谱柱 ，检测波长： 280 nm，柱温箱温度设定： 25℃ ，流速 mL∕min， A 相：%乙酸， B 相：乙腈， 010min B 相由 35%升至 38%， 20min 升至 42%。 2 结果与分析 油 茶三萜皂苷分离纯化 流程图 9 旋转蒸发、冷凝干燥 柱 ⑥ 旋转蒸发、冷凝干燥 柱 ⑤ 油茶三萜皂苷 粗样 900 g 蒸馏水浸泡 AB8 大孔树脂（柱 ① ： 1100 g；柱 ② :540 g）吸附 柱 ① ： L 柱 ② : L 柱 ① ： L 柱 ② : L 柱 ① ： L 柱 ② : L 柱 ① ： L 柱 ② : L 水、乙醇（ 30%、 80%、 95%）梯度洗脱 蒸馏水洗脱 30%乙醇洗脱 80%乙醇洗脱 95%乙醇洗脱 弃去（蛋白、色素、 黄酮类） 得 油茶三萜皂 苷 粗样 149 g,取30 g 弃去（色素、糖类） 旋转蒸发、冷凝干燥 每 500 ml 一个组分，共 30 个组分 （柱 ③ ： 15 个。 柱 ④ 15 个） : 洗脱液： CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:8） 甲醇溶解， 30 g 硅胶拌样， 1 kg 硅胶（ 100200 目）湿法装柱 (柱 ③ ： 478 g。 柱④ :522 g) ))洗脱液浸泡，搅匀装柱 fr1 g 咖啡色粉末 fr2fr5 g 黄白色粉末 fr6fr10 g 棕色粉末 fr11 g 浅棕色粉末 fr12fr15 g 深棕色粉末 柱 ③ 柱 ④ fr1 g 咖啡色粉末 fr2fr4 g 黄白色粉末 fr5fr11 g 棕色粉末 fr12fr15 g 深棕色粉末 洗脱液： CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:6） 洗脱 每 500 ml 一个组分，共 9 个组分 柱 ③ fr2: g，甲醇溶解， 7 g 硅胶拌样， 430 g 硅胶（ 200300 目）湿法装柱（柱 ⑤ ） fr1fr2 黄色粉末 含部分晶体 fr3 米白色粉末 fr4fr6 黄白色粉末 fr7fr9 浅黄色粉末 洗脱液： CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:6） 洗脱 每 500 ml 一个组分，共 8 个组分 柱 ④ fr2: g，甲醇溶解， g 硅胶拌样， 430 g 硅胶（ 200300 目）湿法装柱（柱 ⑥ ） fr1 黄色粉末 fr2 米白色粉末 fr3fr5 黄白色粉末 含部分晶体 fr6fr8 浅黄色粉末 含部分晶体 10 本研究 以 油茶三萜皂苷 粗品为原料，分别经过 AB8 大孔树脂初步纯化、硅胶（ 100200 目）分离纯化、硅胶（ 200300 目）二次分离纯化、 ODSC18OPN分离纯化、 ODSC18OPN 二次分离纯化 、 HPLC 分离纯化 后得到 油茶三萜皂苷单体组分。 AB8 大 孔树 脂纯化油茶三萜皂苷 油茶三萜皂苷 粗品 900 g，经过 AB8 大孔树脂初步纯化后得到 149 g 样品，其得率为 %。 图 1 中 A 组为 AB8 大孔树脂纯化前的样品 ， B 组为纯化后，柱 ⑤ 3 至 ⑤ 7 和柱 ⑥ 1 至 ⑥ 7 合并（共 g） ,甲醇溶解，过 ODSC18OPN 柱 ,分 4 次上样 分别用 50%、 60%、 65%、 70%、 100%的甲醇梯度洗脱，每梯度 450 ml fr1: g 浅棕黄色粉 fr2: g 米白色。