rnai双链rna引起的基因敲除(编辑修改稿)

rnai双链rna引起的基因敲除(编辑修改稿)内容摘要：

RNA 的合成。 这是因为 RNA 多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，而且合成出的 RNA 不会带有 polyA 尾。 当 RNA 多聚酶Ⅲ遇到连续 5 个胸腺嘧啶时，它指导的转录就会终止，并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来。 U6 启动子能被 RNA 多聚酶Ⅲ识别， 合成出 RNA。 ShiYang[10]等人用 Bluescript 作为载体 ， U6 作为启动子，从绿色荧光蛋白（ GFP）的基因上选择了一个 21 个核苷酸的片断（片断 1），将其插入到 Bluescript 载体中。 然后合成出片断 1 的反向重复序列，并在其后加了 5个胸腺嘧啶，称为片断 2。 他们将片断 2 接到 Bluescript 载体中片断 1 的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的 RNA 由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链 RNA。 片断后面加了 5 个胸腺嘧啶， RNA 转录到这个位置时就会终止。 而且转录出的 RNA 形成发卡样结构后，会在 3’端形成 2 个突出的尿嘧啶，这类似于天然的 siRNA,因而有利 于双链 RNA 诱发 RNAi。 RNA 多聚酶Ⅲ还能识别 H1RNA 启动子。 在 H1RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA[9]。 T7 也可作为启动子合成 dsRNA。 将 PCR 产物用 NotI 酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到 pGEMTeasy 载体上，就构建成了可以表达 dsRNA 的载体。 用此载体可先在体外合成 dsRNA,或将其转入到细胞内合成 dsRNA。 在后一种情况下，还须将能表达 T7RNA 多聚酶的载体也一起转 入到细胞中，以提供能识别 T7 启动子的 RNA 多聚酶 [11]。 双链 RNA 只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达。 而具有发卡结构的双链RNA 能够增加阻断基因表达的时间。 在小鼠畸胎瘤细胞，胚胎干细胞， C2C12细胞中，用长链具有发卡结构的双链 RNA 有效的阻断了报告基因的表达，在稳定表达具有发卡结构的双链 RNA 的细胞株中，报告基因的表达被长期的阻断了[12]。 腺病毒是体内转基因的常用载体。 Xia HaiBin等用腺病毒做载体，在体内和体外表达 dsRNA,并成功的阻断了基因的表达，从而实现了成体动物的基因敲处[13]。 四 . RNAi 的应用 1. 高通量的研究基因功能 在后基因组时代，需要大规模高通量的研究基因的功能，由于 RNAi 能高效特异的阻断基因的表达，因而 RNAi 成为研究基因功能的很好的工具。 研究者将线虫三号染色体上 2232个基因对应的 dsRNA合成出来，并注射到线虫性腺内，然后观察子代细胞分裂时出现的异常表型，结果发现了 133 个基因与细胞分裂异常有关。 其中 104 个基因以前没有发现有这种功能。 在另外一项研究中，线虫一号染色体上的 2416 个基因对应的 dsRNA 被构建到细菌文库中，然后将细菌喂给线虫，观察形态学的异常，异 常的运动，性别比例的变化，不孕的情况，结果将于这些表型有关的基因从 70 个增加到 178 个。 2. 基因敲除 在线虫的体内外试验中， RNAi 都能达到基因敲除的结果，从而成为研究这些基因功能的良好工具。 对于哺乳动物， RNAi 能在体外培养的细胞达到基因敲除的效果，对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用 RNAi 技术研究它的功能。 由于 RNAi 能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。 在线虫体内，胰岛素和受体结合后可以活化 DSOR1,它是 MEK 的类似物， DSOR1 活化后可以 激活 ERKA,它是 ERK 的类似物。 用以 DSOR1为靶目标的 dsRNA可以阻断 DS。