大肠杆菌实验诊断研究进展ppt44-经营管理(编辑修改稿)

大肠杆菌实验诊断研究进展ppt44-经营管理(编辑修改稿)内容摘要：

吹干 ,由激光传感器系统发射 650nm波长激发光激发花青染料 ,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。 O157: H7 生物素 抗体 亲和素 Cy5 样品 • 直接免疫荧光抗体染色 • Park等对粪便样品进行离心后 ,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记 ,可检测到所有培养法证实的菌株 ,检测时间 2h。 5．胶乳凝集 • 该方法是以胶乳颗粒作载体 ,以 O157: H7特异性抗体致敏 ,制成特异的胶乳试剂 ,将标本乳化于玻片或有色烧盘上 ， 滴加胶乳试剂 ,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析 (IEHA) • 该法多用于对 LPS、 可溶性本体抗原 、 未加热抗原的抗体检测 ,对检测 H抗原的抗体效果不佳。 Morooka等检测了 溶血性尿毒综合征 (HUS)病人血清 LPS抗体 ,虽然甲醛化羊红细胞 (SRBC)有低水平非特异性吸附 ,但不影响该方法作为一种有效 、 快速 （ 3h） 的诊断方法。 因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。 7. 全自动抗原抗体检测系统 • VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。 可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌 、 病毒 、弓形虫 、 衣原体和螺旋体等微生物的抗原 、 抗体或毒素。 • 基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物 4甲基 7羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 • 目的是检测大肠杆菌 O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。 基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDSPAGE） 分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。 包括 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。 • 特点是具有比较高的特异性和敏感性。 • 免疫检测 • 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。 • 1) 每条加入 1毫升用 PBS稀释的病人血清，室温震荡 2小时，同时设阳性对照和阴性对照； • 2) 用 ／条 PBST震荡洗涤 3次，每次 5分钟； • 3) 加入用 1毫升用 PBS稀释的 II抗，室温震荡 1小时； • 4) 用 ／条 PBST震荡洗涤 2次，每次 5分钟，再用 PBS洗涤一次； • 5) 将膜放入 12毫升显色液中显色，室温震荡 1530分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ； • 6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相 ； • 7) 当显色的条带和溶血素的分子量或 0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。 二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。 因此其特异性更好。 加之 操作程序自动化使得 DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。 自动化 DNA提取仪，聚合酶链式反应仪 (PCR仪 )， DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪 (用于分离 DNA大片段，如完整的染色体 ) 在疾病诊断中都是很有用的。 1． DNA探针 • 探针 (probe)标记：放射性核素 、 非放射性物质标记。 • 探针的来源 ： ① 克隆的基因组 DNA探针； ② cDNA探针； ⑧ RNA探针； ④ 寡核苷酸探针。 • 标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同。 • 杂交方法：斑点杂交 、 southern印迹 、 原位杂交 、 Northern印迹 等。 • 杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 • O157: H7特异噬菌体上的 sltⅠ 、 Ⅱ 基因 、 大质粒溶血素基因及染色体上 eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。 Beutin等曾用VT1(750bp,)、 VT2(850bp)、 溶血素 ()等探针进行流行病学调查。 Thomas等用地高辛标记的 VT2B亚单位基因 、 VT2C基因探针检测不同噬菌体型 O157: H7菌。 Huck等筛选了 O157: H7大质粒上限制性片段 ,发展了一种 Sma I片段探针 ,认为此探针对 O157: H7血清型最为特异 ,可与所有 O157: H7试验菌杂交。 2. PCR技术 • 聚合酶链式反应技术 （ PCR） 是一种选择性体外扩增 DNA或 RNA片段的方法。 具有特异性强 、 敏感性高 、 快速 、 简便 、可扩增 RNA或 cDNA、 对起始材料质量要求低等优点。 PCR技术扩增体系的基本成分 • 引物 : PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。 由于存在同源序列，随意设计的引物链，其 PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。 引物长度一般为 1530个碱基 ,G+C含量为 40 60%,浓度。 • TaqDNA聚合酶： 浓度为 14ul/100ul。 TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异 DNA扩增。 • 模板 DNA： 应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂及能结合 DNA的蛋白酶。 DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、 SDS裂解法等多种。 • 4 dNTPs ： d。